2006 Fiscal Year Annual Research Report
効率の高い遺伝子修復法を利用した造血系遺伝病の治療法の開発
| Project/Area Number |
17590290
|
|---|
| Research Institution | Saitama Medical University |
|---|
Principal Investigator |
三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (10270901)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大林 富美 埼玉医科大学, 医学部, 研究員 (60406527)
|
|---|
| Keywords | アデノウイルスベクター / 相同組換え / 遺伝子治療 / ファンコニ貧血 / 造血幹細胞 / HPRT / アデノ随伴ウイルスベクター / 遺伝子修復 |
|---|
| Research Abstract |
1、FANCA患者由来B細胞株でのFANCA遺伝子修復
相同組換えによってファンコニ貧血A群(FANCA)遺伝子変異を修復する頻度を測定するために、平成17年度に作製したFANCA遺伝子修復アデノウイルスベクターを増殖・精製した。このベクターは患者で変異のあるエクソン27の正常配列を含む約27kbの相同領域をコードする。相同組換えによりFANCA遺伝子が正常になった細胞は、マイトマイシンC(MMC)耐性になり、相同領域の外にネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを持つため、染色体上のランダムな位置ヘベクターが組み込まれた細胞はネオマイシン耐性となる。このベクターを種々の濃度でFANCA患者由来B細胞株(BCL)に感染させたが、ネオマイシン耐性コロニーもMMC耐性コロニーも得られなかった。
2、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた造血細胞での相同組換え
AAVベクターを用いて相同組換えを試みた。ヒトHPRT遺伝子座由来約3kbの配列のエクソン3にネオマイシン耐性遺伝子を挿入して、AAV-hHPRT-neoを作製した。FANCA修復AAVベクターは、FANCAのエクソン27を含む4.4kb配列をAAVベクターに挿入して作製した。宿主域の異なるAAV1、AAV2、AAV7、AAV8由来の各AAV-hHPRT-neoベクターを、細胞当たり1x10^2-6x10^3コピーの濃度で正常男性由来BCLに感染させたところ、それぞれ感染細胞当たり5x10^<-6>、6x10^<-6>、1x10^<-5>、4x10^<-6>の頻度でネオマイシン耐性コロニーを得た。そのうち相同組換えによりHPRT遺伝子座が破壊されたコロニーを6チオグアニンの存在下で選択した結果、AAV2由来ベクターで細胞当たり2x10^<-6>、AAV8ベクターで1x10^<-6>の頻度で耐性細胞クローンが得られた。FANCA患者由来細胞BCLに対しても、細胞当たり2x10^3ベクターコピーの濃度でAAV2-hHPRT-neoベクターを感染させ、3x10^<-5>の頻度でネオマイシン耐性コロニーを得た。さらに、相同組換えによる修復を検出するためにAAV2-FANCAを細胞当たり2x10^3ベクターコピーで感染させたが、MMC耐性コロニーは得られなかった。
|
