2006 Fiscal Year Annual Research Report
多面的応用が可能な高感度キナーゼ蛍光アッセイ系の開発
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17790093
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
梅澤 直樹 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 講師 (40347422)
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| Keywords | キナーゼ / 検出法 / 蛍光試薬 / スクリーニング / リン酸化 / クマリン / プロテインキナーゼA / カゼインキナーゼ |
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| Research Abstract |
筆者は、リン酸化されたセリンとトレオニンの化学的性質に着目したセリンートレオニンキナーゼの新規蛍光検出法の開発を進めている。具体的には、まず固相に担持した基質ペプチドに、キナーゼを作用させてリン酸化を行い、続く塩基性条件下でのリン酸基のβ脱離により、セリン及びトレオニン残基が炭素-炭素二重結合を有するように誘導化する。この二重結合はマイケル付加を受けやすいため、チオール基等をもつ蛍光性化合物の添加により、リン酸基を有していたセリン或いはトレオニン残基を蛍光性に変換するというものである。既に、固相としてビーズを用いた系で、本検出原理を用いたプロテインキナーゼA活性、カゼインキナーゼ活生の検出に成功しており、本検出原理の一般性が示されている。さらに、本検出系がキナーゼ阻害剤の評価にも用いうることが明らかとなっている。だが、幾つかの問題点が浮き彫りとなった。
本検出法最大の問題点は、基質ペプチドのリン酸化段階にある。現在はビーズに固定化したペプチドを基質としているが、巨大な酵素はビーズ内に浸透できず、基質ペプチドがリン酸化されないことが明らかとなった。そこで、固相としてガラスプレートの使用を計画した。プレートを用いた場合、酵素反応は固相表面で進行し、酵素サイズの影響を受け難いと考えられる。また市販のプレートリーダーを用いることで、大幅な集積化、ハイスループット化が可能になる。
ローダミンを蛍光団とする新規蛍光色素10種を設計、合成し、市販のプレートリーダーに適用可能で、本アッセイ系に適用しうる新規蛍光試薬の開発に成功した。ペプチドを担持する固相として、様々なプレートアレイを検討したところ、その表面加工により、非特異的な蛍光の強度が大きく異なることが明らかとなった。現在最適なプレートを探索中である。
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