2018 Fiscal Year Annual Research Report

Comprehensive analysis of pathogenic ncRNA in host environment

Research Project

Project/Area Number	17F17421
Research Institution	Teikyo University
Principal Investigator	関水和久帝京大学, 医真菌研究センター, 教授 (90126095)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	PANTHEE SURESH 帝京大学, 医真菌研究センター, 外国人特別研究員
Project Period (FY)	2017-10-13 – 2020-03-31
Keywords	機能性RNA / 黄色ブドウ球菌 / 網羅的遺伝子発現解析
Outline of Annual Research Achievements	ncRNAの網羅的遺伝子発現解析：黄色ブドウ球菌のこれまでアノテーションされたncRNA遺伝子の中には、アルゴリズムによる予測よるものなどが含まれているため、実際には発現していなかったり、発現の向きが逆であったりするため、再構築を行う必要があった。今回、試験管内での培養条件と、宿主環境下の条件から抽出したRNAを用いたRNA-Seq解析の結果を用いて、ncRNA遺伝子の再アノテーションを行った。その再アノテーションされたゲノム情報を用いてncRNAの発現解析を再度実施し、心臓、肝臓、腎臓において共通して発現上昇する25遺伝子のncRNA遺伝子を同定した。病原性に寄与するncRNAの解析：rsaC遺伝子破壊株についてマウスの臓器中の菌の生存数を野生型株と比較したところ、予想外なことに感染後24時間まで差が認められなかった。従って、感染後期のマウスを殺傷が始まる段階においてrsaCの機能が働いていることと考えられる。マウスモデルは感染実験を行うために倫理的な制約があることから、より簡便に倫理的な制限がないカイコモデルでの病原性を検討した。その結果、野生型株とrsaC遺伝子破壊株とでカイコの殺傷性には差が認められないことがわかった。そのため、野生型株とrsaC遺伝子破壊株を感染させたマウスの臓器を摘出し、RNA-Seq解析を実施した。その結果、rsaC遺伝子破壊株では野生型株と比べて複数の病原性因子の発現が有意に低下していた。一方、試験管内ではそのような遺伝子発現変動は認められなかったことから、宿主内でのみ観察される現象である可能性が考えられる。さらに、我々の研究によって同定した新規病原性遺伝子破壊株の試験管内での培養条件における網羅的遺伝子発現解析を行い、ncRNA遺伝子に対する発現変動を解析した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究方針を若干変更しncRNA遺伝子リストの再構築を行い、RNA-Seq解析を再度実施することとした。そのため、rsaC遺伝子以外のncRNA遺伝子の破壊株作成が計画より遅れているが、現在複数の株について樹立を試みている。本ncRNA遺伝子のリストは、今後の黄色ブドウ球菌の病原性及び生理学的な機能を解析する上で必須な情報であることから、非常に重要な進展があったと判断した。また、当初計画通りrsaC遺伝子の病原性への寄与におけるメカニズムの一端を明らかにすることができた。本研究における主目的である新規ncRNA遺伝子の機能解析については機能に関する重要な知見が得られていることから、おおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	rsaC遺伝子産物によって発現が直接制御される遺伝子を同定する。具体的には、これまでの解析において遺伝子破壊株と野生型株とで宿主内及び試験管内とで発現変動に相関が認められた遺伝子について、プロモーター下流にGFPをつないだベクターを作成し、rsaC遺伝子破壊株と野生型株とで発現量に差が認められるか否か検討する。さらに、rsaC遺伝子の病原性への寄与について得られたデータを整理しまとめ作業を実施する。また、整理しなおしたncRNA遺伝子リストについて、情報を公開できる形として整理する。