2018 Fiscal Year Annual Research Report
Oxygen imaging of 3D living cells using multi-color oxygen sensing probes
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17H02078
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
吉原 利忠 群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (10375561)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | りん光 / イリジウム錯体 / りん光寿命 / イメージング / 酸素 / スフェロイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，イリジウム錯体を基軸としたマルチカラー発光酸素プローブ分子を設計・合成し，３次元培養された積層細胞内や細胞塊(スフェロイド)内の酸素濃度および濃度分布を，共焦点顕微鏡を用いて高感度，非侵襲的にリアルタイム計測・イメージングすることである。
平成30年度は，芳香族配位子にジエチルアミノクマリン類，補助配位子にエチレンジアミン類を用いたカチオン性イリジウム錯体の合成を行い，スペクトル特性，光物理特性，電気化学特性に関する測定を行った。また，細胞移行性の実験からエチレンジアミンの窒素原子に結合した水素をアルキル鎖に置換した化合物において高い細胞親和性およびスフェロイド透過性が向上することを見出した。開発したイリジウム錯体はりん光寿命が長いため，市販のマイクロプレートリーダーの時間分解計測機能を用いることで，りん光寿命計測ができることがわかった。生細胞にイリジウム錯体を取り込ませ，細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ，呼吸を活性化する試薬では，細胞内の酸素濃度が時間に依存して減少すること，一方，呼吸を阻害する試薬では，酸素濃度が増加することを定量的に示した。
平成29年度に開発した共焦点蛍光・りん光寿命顕微鏡を用いることで，スフェロイド内部が低酸素状態になることを定量的に示した。また，平面培養細胞と同様に細胞の呼吸活性を変化させる試薬を添加したところ，スフェロイドにおいても細胞内の酸素濃度が時間に依存して変化することを定量的に明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は，イリジウム錯体を基軸としたマルチカラー発光酸素プローブ分子を設計・合成し，３次元培養された積層細胞内や細胞塊(スフェロイド)内の酸素濃度および濃度分布を，共焦点顕微鏡を用いて高感度，非侵襲的にリアルタイム計測・イメージングすることである。
平成30年度は，可視光から近赤外光領域にりん光を示し，また，りん光寿命が長いカチオン性イリジウム錯体の合成，および溶液中における物性評価を行った。開発したイリジウム錯体を用いて細胞内移行性や細胞内におけるりん光特性に関する実験を行った。その結果，高い細胞親和性を示すイリジウム錯体の構造やスフェロイド内における酸素濃度勾配について明らかにした。さらに，市販のプレートリーダーを用いることで，生細胞内の酸素化状態が検出できる方法論を確立した。
以上の結果は，平成30年度に達成すべき目標であることからおおむね順調に研究が遂行できたと考えている。現在，成果を投稿論文にまとめている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は可視光から近赤外光領域にりん光を示すイリジウム錯体の開発を行った。平成31年度は，寿命計測法を用いることなく，細胞内の酸素レベルを明らかにするプローブ分子を開発する。具体的には，蛍光団とりん光団をオリゴアルギニンリンカーで結合させた分子を合成し，蛍光強度とりん光強度の比（レシオ）を計測する。開発した酸素プローブを用いて，スフェロイド内部の酸素濃度をレシオ法によって明らかにする方法論の確立を目指す。
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