2017 Fiscal Year Annual Research Report
新規遺伝子Fam64aを用いた心筋再生医療に向けた基礎的検討
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17H02092
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
橋本 謙 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80341080)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
毛利 聡 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00294413)
花島 章 川崎医科大学, 医学部, 助教 (70572981)
氏原 嘉洋 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80610021)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心筋細胞 / 分裂 / 再生 / 酸素 / Fam64a |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の心筋細胞は胎児期には活発に分裂して原始心臓を形成するが、出生後は分裂を停止する。従って、成体では虚血性心疾患等で失われた心筋細胞を再生することは出来ず、故に本疾患は致死的であり、治療戦略の開発が急務である。我々は最近、心筋分裂には低酸素環境が必須であり、哺乳類では胎児期の子宮内低酸素環境から、出生後の肺呼吸開始による酸素濃度の増加が心筋分裂を停めることを突き止めた。また、低酸素下の胎児心筋において分裂を促進する最重要遺伝子としてFam64aを同定した。Fam64aは胎児期心筋の核に強く発現して細胞周期を促進するが、出生後は発現が激減する。本年度は、Fam64aの発現が減少する出生後に心筋特異的に発現が増強する過剰発現マウスの作製を試みた。本マウスは出生後も心筋の細胞周期回転が維持され、成体期での心筋分裂・再生能の向上が期待される。心筋特異的プロモーターの下流にFam64a配列を繋いだ遺伝子をマウス受精卵にインジェクションすることにより過剰発現マウスを得た。本マウスは正常に発生し、心筋組織像や心体重比は野生型と相違なかった。しかし、成体期心筋では細胞分裂マーカーの発現率や細胞周期遺伝子の発現が増強しており、分裂能の向上が示唆された。一方、心エコー解析では加齢に伴い、逆に心機能が悪化しており、長期的且つ過剰な細胞周期活性による心機能悪化が示唆された。また、我々は心筋分裂にはFam64aの発現だけでなく、細胞周期のM期におけるユビキチンリガーゼAPC/CによるFam64aの分解が必須であることを突き止めた。そこで、我々が確立したバキュロウイルスを用いた遺伝子導入法により、成体期の単離心筋にFam64a及びAPC/Cを適切に発現させ、細胞周期に応じたFam64aの周期的増減を再現することで、慢性的な過剰発現を防止し、心筋分裂・再生能の更なる向上を目指して実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は分裂が盛んな胎児期心筋細胞の分裂制御メカニズムを解明し、これを成体心筋へ適用することで再生医療の実現を目指す研究を進めている。その過程で、低酸素環境下の胎児心筋細胞において細胞分裂を促進する最重要遺伝子としてFam64aを同定した。本年度は、当初の計画通り、Fam64aの心筋特異的過剰発現マウスの作製を試み、予定通り作製することができた。本マウスについて個体から分子・遺伝子レベルに渡る網羅的な表現型解析を進めており、上記の実績で述べたように、成体期心筋の分裂能向上を示唆する結果を得ることが出来た。一方で、Fam64aの長期的な発現に伴う過剰な細胞周期活性が逆に心機能を悪化させる可能性についても重要な知見を得ることが出来た。これについては、Fam64aが細胞周期のM期においてユビキチンリガーゼAPC/Cによって分解される、即ち、細胞周期に応じてFam64aの発現が周期的に増減することが胎児心筋の分裂に必須であるという我々の知見から鑑みて妥当な結果であると考えられる。現在、我々が確立したバキュロウイルス遺伝子導入法を用い、Fam64aとAPC/Cの発現を適切に制御することにより、Fam64aの周期的増減を再現し、成体期心筋の分裂・再生能向上を目指して検討を重ねている。更に、当初の計画通り、Fam64aの心筋特異的ノックアウト（KO）マウスの作製も進めている。具体的には、CRIPSR/Cas9を用いたゲノム編集技術により、Fam64a遺伝子の特異的エクソンの両端にloxP配列をノックインしたマウスを作製し、心筋特異的Creマウス（Nkx2.5-Cre；胎生早期から活性がON）との交配により心筋特異的Fam64a KOマウスを得る予定である。本マウスでは、胎児期心筋の細胞周期の阻害、及び心筋分裂能の障害が想定される。上記の過剰発現マウスと同様の表現型解析を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
バキュロウイルスを用いた遺伝子導入法による成体期心筋の分裂・再生能促進効果の検討については、上記の実績、及び進捗状況で述べたように単離心筋細胞を用いて検討を重ねているが、成体期の心筋細胞への遺伝子導入は通常の株細胞や胎児期の心筋細胞に比べて極めてハードルが高く、現在のところ高確率な発現が実現出来ていない。改善策として、心筋細胞の単離プロトコルの改良による細胞ダメージの軽減、培地や培養基質の検討（フィブロネクチンではなくラミニンが最適であることを検討済み）、及びバキュロウイルスベクター内のプロモーター配列の改善等を行う。また、Fam64aの過剰発現及びKOマウスについて、通常の表現型解析だけでなく、当初の計画通り、(1) 心筋梗塞マウス（冠動脈前下行枝の閉塞）、及び (2) 心臓冷却傷害マウス（液体窒素プローブによる冷却傷害）といった心臓傷害モデルに対し、最適量のバキュロウイルスベクター2種類（Fam64a, APC/C）を尾静脈より投与し、心筋分裂・再生能の向上（分裂マーカー定量、細胞周期遺伝子の発現解析、分裂タイムラプス解析）、及び心機能の回復（心エコー、摘出心の圧-容積関係、Ca2+測光）を評価する。これらの評価は傷害後の急性期（24時間）から慢性期（～3か月）までフォローし、治療効果を詳細に解析する。用いるバキュロウイルスは心筋特異的プロモーターを搭載しており、静脈投与においても心筋特異的な発現が実現できる。更に、川崎医大附属病院との連携のもと、ヒト心筋梗塞症例の患者からカテーテル治療中に生検にて心筋組織を採取後、心筋細胞を単離し、最適量のバキュロウイルスベクター2種類（Fam64a, APC/C）の導入による分裂・再生促進効果の検討（in vitro）を行う。得られる情報は将来的なヒト心臓再生医療に向けた基盤となる。
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