2018 Fiscal Year Annual Research Report
Piezoelectric Material Aided Electromagnetic and Mechanical Stimulation Bioreactor for Regeneration of Three Dimensional Nerve Network System
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17H03150
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
仲町 英治 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60099893)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 浩司 同志社大学, 生命医科学部, 准教授 (70536565)
森田 有亮 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (80368141)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 神経再生培養装置 / 擬似神経細胞 / 電磁場刺激 / 力学刺激 / コンピュータシミュレーション / 圧電材料 / 三次元培養 / 再生用足場 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，交流電圧磁場刺激および圧電薄膜設置と繰り返しひずみ負荷による力学・電場刺激の重合による神経細胞活性が可能な三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタの開発を目指す．本年度の研究では，交流磁場，直流電場，繰返し引張りひずみ場の個別の負荷による軸索伸展効果の確認を行った．生体適合圧電材料MSOによるひずみ・電磁場刺激の軸索伸展促進効果が非常に低いことから，新たに圧電ポリマーPVDFを採用し，繰返し引張りひずみおよび電界刺激を負荷する装置の設計と製作を行った．再生用足場材料として，コラーゲンゲル，ポリマーゲルおよび生体由来の低分子アミノゲルを採用し，三次元チャンバー内に播種したPC12，N1細胞，マウス由来の大脳皮質初代細胞に対する磁場，電場，力学場刺激の単独効果の検討を行った．以下に，主要５課題の研究成果を示す．
（１）三次元神経ネットワーク形成予測のために，細胞外環境の影響を考慮可能なCA法と有限要素法によるハイブリッドコンピュータシミュレーションプログラムの開発を行った．（２）コラーゲンゲルに加えて低分子アミノ構造ゲルを導入し，軸索促進効果の最適化を図った．また，接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ，接着強度の増加，さらには軸索伸展の加速を可能にした．
(3)本年度は高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し，圧電効果をによる軸索伸展促進の評価を行った．(４)完成した三次元磁場負荷装置を用い，神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件の探索を行い，磁場強度と細胞間距離の軸索伸展への影響に関して，細胞間距離に関しては閾値（100μm）があることを見出した．
（５）本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験の予備実験を行った
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
主要５課題の研究成果を示し，研究が予定通り進んでいることを示す．
(1)本年度は，細胞が一様配置された場合の細胞間距離の相違による細胞外基質および細胞に生じるひずみ・応力場を求め，細胞の活性に寄与する力学刺激の定量化を行った．(2)本年度はコラーゲンゲルに加えて低分子アミノ構造ゲルを導入し，軸索促進効果の最適化を図った．また，接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ，接着強度の増加，さらには軸索伸展の加速を可能にした．(3)昨年度に製作した力学刺激および電場刺激が可能な三次元バイオリアクタによる軸索伸展促進効果のための最適条件探索のための実験を進めた．細胞はPC12に加えN1細胞を採用した．しかし，新規圧電材料MSOの電界強度が非常に小さいために，本年度は高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し，コラーゲンおよびラミニンコーティングによる軸索伸展の加速を目指し，本圧電ポリマーが有効であることを確認した．
(4)本年度は，完成した三次元磁場負荷装置を用い，神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件の探索を行い，磁場強度と細胞間距離の軸索伸展への影響に関して，細胞間距離に関しては閾値（100μm）があることを見出し，それ以上の距離においては磁場（4μT）刺激に伴い軸索伸展が加速することを見出した．（５）本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験の予備実験を行った：磁場および力学場刺激において，初期の細胞播種による細胞配置が軸索伸展に大きな影響を及ぼすことが判明した．さらに，磁場刺激による軸索配向の制御が困難であることを見出した．以上のことを考慮し本年度は電極を三次元バイオリアクタ内に設置する直流電場刺激装置の設計製作を行った．
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| Strategy for Future Research Activity |
本申請の主要な研究５課題の研究計画を示す．
(1)三次元神経ネットワーク形成予測シミュレーションプログラムの開発：力学刺激下での神経軸索伸展の大規模シミュレーションが可能なCA法と有限要素法による解析手法の開発を行う．(2)三次元バイオリアクタ足場としてコラーゲンゲルおよび低分子アミノ構造ゲルを採用し，軸索促進効果の最適化を図る．また，接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ，接着強度の増加，さらには軸索伸展の加速を可能にする実験法の確立を図る．(3)高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し，足場・接着誘引剤の選定およびPC12を主に用いて軸索促進効果の評価を行う．
(４)三次元磁場負荷装置を用い，神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件探索およびMPM観察による細胞体配置と軸索伸展の関係を定量評価する．（５）本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験を行う：最終目標は，電磁場・力学の融合刺激が可能な三次元バイオリアクタの設計製作と刺激効果の評価である．昨年度までの研究を考慮し，本年度は電極を三次元バイオリアクタ内に設置する直流電場刺激装置の設計製作を主目標に設定する．中枢神経のex-vivo形成過程において，直流電場刺激による軸索ネットワークの形態制御が可能であること，さらに軸索伸展促進が可能であることを確認する．個別の課題として，細胞の均一細胞間距離の配置が可能な播種用デバイスの開発，および三次元力学刺激における，細胞間距離と力学刺激の関係を明らかにすることで最適な細胞初期配置と力学刺激量を探索することも目指す．最終的には，力学・電場刺激の融合負荷を可能にすることで任意配向制御が可能な三次元バイオリアクタの完成を目指す．
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