2017 Fiscal Year Annual Research Report
Simultaneous production of monoclonal antibodies against multiple membrane proteins and their evaluations for the applications to therapeutic medicines
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17H03468
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
冨田 昌弘 三重大学, 工学研究科, 教授 (20183494)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 秀雄 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (40361167)
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 准教授 (80362359)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 立体構造認識モノクローナル抗体 / 誘電泳動 / 無細胞発現系 / プロテオリポソーム / 分子標的治療薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．標的タンパク質GPCR（Gタンパク質共役受容体）であるβ2ARとCRHR1のcDNAを組込んだ発現ベクターを構築した．これらは，DNA免疫に使用できる．また，GPCR (β2AR他) 等を発現する組換えミエローマ細胞を作製するため，蛍光タンパク質遺伝子を融合した組換えプラスミドベクターを構築し，標的タンパク質の一過性および安定発現を蛍光タンパク質を指標として確認できた．
２．単一B細胞から，直接モノクローナル抗体を取得する新規な手法であるEcobody法を用いて，上皮成長因子受容体などの立体構造認識するウサギモノクローナル抗体候補を複数取得した．また同様な手法でヒトモノクローナル抗体も得ることができた．本研究結果により抗体創薬において非常に重要であると考えられる，ウサギとヒトモノクローナル抗体の構造認識抗体取得への技術的課題のひとつをクリアすることができた．
３．マイクロウェルアレイ電極（25万ウェル）を用いた正の誘電泳動により，ウェル内にミエローマ細胞を誘導しミエローマ細胞アレイを作製した．電気パルスによるエレクトロポレーションによりウェル内の細胞にGFP発現用プラスミドを導入できた．さらに，ウェル内に正の誘電泳動を用いてB細胞を導入しミエローマ細胞－B細胞ペアを形成することができた．また，負の誘電泳動を用いてウェル内に捕捉した細胞をウェル外に排除することができた．
４．GPCR(β2AR他)等を新たに人工脂質膜上へ組換えバキュロウイルスの出芽粒子から展開する方法を検討した．吸着と融合の挙動が，塩濃度，混合するリポソーム脂質の組成に依存し，結果，得られる再構成膜の性状に差異が認められた．組換え受容体が不均一に分布する状態も認められるが，適切に条件を選ぶことによって，受容体が均質に分布した再構成膜が得られることが分かった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．標的のGPCR (β2AR他)等の高次構造を認識するモノクローナル抗体作製のために，マウスのDNA免疫が必須である．この目的のための組換えプラスミドベクターを構築することができた．また，B細胞受容体 (BCR) を介して感作B細胞を選択するために必要となる，GPCR (β2AR他)等発現組換えミエローマ細胞を蛍光タンパク質を指標として得ることが出た．
２．当初予定していたEGF受容体に対するウサギモノクローナル抗体の候補を複数取得した．またヒトモノクローナル抗体においても同様な手法を開発した．
３．初年度に，高効率な電気パルス細胞融合に必要な細胞操作の要素技術を獲得できた．微粒子や細胞の迅速，一括，高効率なウェル内に誘導し捕捉できた．さらには，ウェル選択的に細胞を誘導することを可能にした．目的とする1ウェルに細胞を導入することや，導入された細胞の中から目的とするウェルからのみ細胞を回収することが可能となった．当初予定していた自由度以上の細胞操作を達成できた．また，配列化細胞への電気パルス印加による遺伝子導入や細胞融合を行うことができた．
４．多様な抗原特異性を持った抗体産生細胞群の中から，分子標的治療薬抗体の候補となるモノクローナル抗体を選別できる評価系を構築することをめざすための準備として，H29年度は，GPCR(β2AR他)等を新たに人工脂質膜上へバキュロウイルスから展開する方法を検討した．抗体分子との結合性の検査の課題が残ったが，組換え受容体の膜上での分散状態を，融合タンパク質タグからの蛍光輝度の分泌状況から判断し均一に分布する条件を見出している．
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| Strategy for Future Research Activity |
１．H29年度に構築された標的タンパク質GPCR（β2AR他）等のcDNAを組み込んだ発現ベクターを用いてDNA免疫を行う．DNA免疫によって感作されたB細胞を，B細胞受容体(BCR)に基づき標的タンパク質発現ミエローマ細胞によって選択する．抗原抗体反応によって架橋形成された両細胞を電気パルスにより選択融合し，立体構造認識抗体産生ハイブリドーマを得る．さらに，このハイブリドーマ作製方法を深化させ，ダブルターゲティング法による多種抗膜タンパク質抗体作製を検討する．
２．H29年度の研究より得られた，受容体認識するウサギモノクローナル抗体の候補の解析をすすめる．さらにDNA免疫法を組み合わせ，高次構造認識ウサギモノクローナル抗体取得を試みる．
３．昨年度，マイクロウェルアレイ電極を用いた誘電泳動により，微粒子や細胞をウェル内に導入しアレイを作製することができた．抗体（または抗原）を固定化した微粒子をウェル内に捕捉し，その上に抗原（または抗体）を発現した細胞を誘導し接触させる．この手法により標的抗原を発現した細胞のみマイクロウェルアレイ内に濃縮する．この技術を開発し，B細胞の濃縮に利用するとともに，細胞の融合効率の向上を行い高効率な高性能ハイブリドーマの作製方法を確立する．
４．分子標的治療薬抗体の候補となるモノクローナル抗体を選別できる評価系を構築することをめざす．H29年度の進展により，GPCR(β2AR他)等を安定に支持のある人工膜（プロテオリポソーム）を構成できることが確かめられた．H30年度は，抗GPCR抗血清を含む抗体分子との結合性の解析をさらに深めるとともに，GPCR以外の他の組換え抗原への適用可能性を検討し，人工膜系の性能向上を図る．
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