2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of a tRNA conversion mechanism of transsulfursome by the structural analysis of quaternary complex
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17H03637
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (40311518)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (80380525)
田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | transsulfursome / Cys-tRNA(Cys) / アミルアシルtRNA合成 / 間接合成経路 / 結晶構造解析 / クライオ電顕解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
古細菌におけるCys-tRNA(Cys) の生合成は，2 つの酵素，SepRS とSepCysS が，それぞれ触媒する２段階の反応から成り立っている．申請者らは，この反応を推進するためには，第3のタンパク質SepCysE がSepRS とSepCysS をつないで3者複合体（transsulfursome）を形成することが必須であることを明らかにした．本研究では，そのtranssulfursome とtRNA から成る４者複合体の構造解析により，transsulfursomeが２つのリンカーを利用して動的なtRNAをプロセスする分子機構を明らかにする．そのために，2018年度に引き続き，2019年度に下記のように研究を進めた．
2018年度に確認、および大量調製できた、各反応段階でのtRNA結合状態を維持することができるtranssulfursomeの変異体とtRNAの複合体を用いて、結晶構造解析と電子顕微鏡の単粒子構造解析を進め、さらにAFMによる動的構造変化の解析も試みた。その結果、transsulfursomeが、クライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析のための凍結グリット作製に耐えらず、ネガティブ染色法による解析は有効であることが分かり、さらに、金ナノプローブを用いたネガティブ染色TEMで、transsulfursomeのボディーに対して、フレキシブルドメインやtRNAの位置を特定することが可能である予備実験も成功した。また、ネガティブ染色TEMでの観察によって、第１段階反応でのtRNA結合状態を維持する変異体transsulfursome(del_RRF)(SepCysSの３残基削除)は、tRNAと結合するとより曲がっていることが分かった。これは、私たちの仮説であるSepCysEのCTDが第１段階反応でも、tRNAと結合するためと考えられる。
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| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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