2018 Fiscal Year Annual Research Report
Structural Biology of Molecular Mechanism of Hydrogenase Maturation Proteins
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17H03642
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三木 邦夫 京都大学, 理学研究科, 名誉教授 (10116105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤橋 雅宏 京都大学, 理学研究科, 助教 (10397581)
渡部 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (50432357)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / X線結晶解析 / 成熟化タンパク質 / ヒドロゲナーゼ / 構造機能相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
超好熱性アーキア T. kodakarensis由来のヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質の構造・機能解析として，ヒドロゲナーゼへのNi原子の組み込みに関わるHypAとヒドロゲナーゼ大サブユニットHyhLとの複合体の結晶構造解析を行った．得られた二種の複合体結晶（空間群C222およびP23）について，構造精密化を完了して，空間群C222の結晶については3.30A分解能でR値30.0 %，空間群P23の結晶については3.24A分解能でR値30.5 %の最終構造が得られた．
ヒドロゲナーゼ大サブユニット HyhL（未成熟型）とHypAとの複合体は，二つの相互作用部位によって形成されていた．HyhLのN末端は分子の外側に突き出ており，HypAのNi結合ドメインと相互作用して新たなβシートを形成していた．変異体実験から，このβシートはHypAとの複合体形成に必須なものであることが分かった．もう一つは，HypAのNi結合ドメインの2本のヘリックスとHyhL間の疎水性相互作用である．複合体形成の結果，HypAのNi結合サイトは，HyhLのNiFe活性中心で配位に関与する三つのシステイン近傍に位置することになり，NiイオンはHypAのNi結合部位から直接HyhLに受け渡されることが示唆された．
成熟化プロテアーゼに関して，HybDに加えて，このアーキアに存在するもう一つの成熟化プロテアーゼHycI（HyhLに対しても触媒作用がある）の結晶構造解析を完了した．精密化の結果，1.59A分解能でR値20.2%の最終構造を得た．全体構造はこのアーキア由来のHybDと類似していたが，HybDより長いループ構造を持ち，その結果，広くて深いクレフトを形成していた．このクレフトが基質認識に影響を与えている可能性があることが分かった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
成熟化タンパク質HypAとヒドロゲナーゼ大サブユニットHyhLの複合体については，精密化を完了して最終構造を得ることができた．その構造に基づいて，Ni原子組み込みの機構を詳細に検討し，NiイオンはHypAのNi結合部位から直接HyhLに受け渡されることが分かった．
また，このアーキアに存在するもう一つの成熟化プロテアーゼHycIについても最終精密化構造が得られた．その構造に基づいて，このHycIに存在する長いループ構造が広くて深いクレフトを形成し，このクレフトが基質認識に関わっている可能性を示唆することができた．
一方では，この複合体結晶の分解能を向上させることはできなかった．また，HypCとHyhLの二者複合体やHyhL-HypC-HypA三者複合体には成果が得られなかった．
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| Strategy for Future Research Activity |
構造を決定した成熟化タンパク質HypAとヒドロゲナーゼ大サブユニットHyhLの複合体について，複合体形成部位ならびにNi原子結合部位をさらに詳しく解析することで，Ni原子組み込み機構を解明する．より詳細な構造情報を得るため，この複合体結晶の分解能の向上を継続し，それが可能になれば，構造に基づいた相互作用解析によって，超好熱性アーキアT. kodakarensisのヒドロゲナーゼ成熟化におけるさらに詳細なNi原子組み込み機構を解明できる．これまで成功していないHypCとHyhLの二者複合体，HyhL-HypC-HypA三者複合体についてはそれらの調製条件の検討を継続する．当研究室でこれまでに構造を決定したヒドロゲナーゼ成熟化タンパク質群の構造生物学的知見，ならびに関連する研究者によって明らかにされた生化学的および構造生物知見を総合的に考察することで，金属原子取り込み機構およびヒドロゲナーゼ成熟化の分子機構の全体像を解明する．
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