2017 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of heterochromatin formation and chromosome segregation by centromeric noncoding RNAs
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17H03712
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
谷 時雄 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (80197516)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 染色体 / セントロメア / ノンコーディングRNA / イントロン / ヘテロクロマチン形成 / 分裂酵母 / RBMX |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体の分離は紡錘糸の動原体への結合によって行われるが、その際、セントロメア領域のヘテロクロマチン化が動原体構築に必須である。分裂酵母では、セントロメアから転写される非翻訳性RNA(ノンコーディングRNA; ncRNA)がRNA干渉システムを介してセントロメアヘテロクロマチン形成を行う。本研究では、染色体構築及び分離におけるncRNAの機能を、セントロメアncRNAイントロンによる活性化機構を含めて、分裂酵母とヒト培養細胞のそれぞれを用いて解析し、染色体動態におけるセントロメアncRNAの普遍的な役割と、それぞれの生物種特異的に進化したシステムの解明を目指す。平成29年度では、分裂酵母のdg ncRNAイントロンによるヘテロクロマチン形成活性化機構を解明するため、dgイントロンとユークロマチン領域の遺伝子gcd10のイントロンを部分的に入れ替えたキメライントロンを多種作成し、dg イントロンの5’側領域46塩基がヘテロクロマチン形成活性化に重要であることを明らかにした。更に、その領域に結合する可能性のある機能未知RNA結合タンパク質SPAC30D11.14cを同定した。この遺伝子の欠失変異株はセントロメアヘテロクロマチン形成に異常を示し、ヘテロクロマチン形成機構に関与する新規因子である可能性が示唆された。また、ヒト細胞におけるセントロメア由来ncRNAの機能を解明するため、セントロメアncRNAに結合する因子RBMXについて詳細な解析を行い、この因子がM期特異的にセントロメアncRNAに結合し染色体分離に重要な役割を担っていること、更には、セントロメアncRNAがRBMXタンパク質量の維持に必須であることなどを発見した。以上の結果から、ヒトセントロメアncRNAが細胞内でRNP複合体を形成し、染色体分離をコントロールしている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
29年度研究計画に記載の分裂酵母における in vitro siRNA産生系の構築は、残念ながら様々な問題点が浮上して予定通り進まなかったが、セントロメア dg ncRNAイントロンによるヘテロクロマチン形成活性化機構については、形成活性化に関与する新規RNA結合タンパク質SPAC30D11.14cを同定することができ、本研究にとって大きな進展があった。
また、ヒト細胞を用いた解析も、セントロメアncRNAに結合する因子RBMXについて詳細な解析を実施でき、この因子がM期特異的にセントロメアncRNAに結合し染色体分離に重要な役割を担っていること、セントロメアncRNAがRBMXタンパク質量の維持に必要不可欠であることなどを発見した。これらの結果は、ヒトセントロメアncRNAの染色体分離制御における機能を解明する上で、非常に有用な知見である。RBMXに関する研究成果は、論文にまとめて国際誌 Genes to Cells に発表できた(Cho et al., Genes to Cells, 23, 172-184, 2018)。以上の結果から、本研究課題は「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
分裂酵母における in vitro siRNA産生系の構築は、細胞抽出液の調製法を改良して更に進める予定である。また、昨年度の解析により、ATP dependent DNAヘリカーゼをコードするmRNA核外輸送遺伝子ptr8+に変異を持つ分裂酵母変異株が、セントロメアヘテロクロマチン形成異常を示すことを見いだした。そのメカニズムを解明するため、ptr8変異株のマルチコピーサプレッサーをスクリーニングし相互作用因子を同定する実験を、新たな研究プロジェクトとして開始する。
ヒト細胞を用いた解析では、質量分析により同定したRBMX以外のセントロメアncRNA複合体構成因子のうち、YB-1、IMP-3について、siRNAを用いたノックダウンや過剰発現による機能解析を進める。細胞生物学/生化学的手法を駆使して解析を進め、ヒトセントロメアncRNA複合体におけるこれら因子の機能を解明する。
昨年度までの解析により、セントロメアsatellite I ncRNAをDNA/RNA アンチセンスオリゴヌクレオチド（sat I ASO）でノックダウンすると、U2OS細胞などの悪性度の高い培養がん細胞の増殖が強く抑制されることを明らかにした。そこで、今後、satellite I ncRNAを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの新規抗がん医薬応用への可能性について検証していく。30年度では、担癌マウスを用いたsatellite I ASO抗腫瘍効果のin vivo解析を行う予定である。
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