2019 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of heterochromatin formation and chromosome segregation by centromeric noncoding RNAs
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17H03712
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
谷 時雄 熊本大学, 大学院先端科学研究部(理), 教授 (80197516)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ノンコーディングＲＮＡ / セントロメア / ヘテロクロマチン形成 / 染色体動態 / 分裂酵母 / YB-1 / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体の分離は紡錘糸の動原体への結合によって行われるが、その際、セントロメア領域のヘテロクロマチン化が動原体構築に必須である。分裂酵母では、セントロメアから転写される非翻訳性RNA(ノンコーディングRNA; ncRNA)がスプライシング因子Prp14なども介したRNA干渉システムによりセントロメアヘテロクロマチン形成を行う。本研究は、染色体構築及び分離におけるncRNAの機能を、分裂酵母とヒト培養細胞のそれぞれを用いて解析し、染色体動態におけるセントロメアncRNAの普遍的な役割と、それぞれの生物種特異的に進化したシステムの解明を目的としている。令和元年度では、分裂酵母mRNA核外輸送因子Ptr8pがヘテロクロマチン形成に関わるncRNAをペリセントロメア領域に保持する機構についてRIP法等を用いて解析し、Ptr8pがセントロメアncRNAに結合することで染色体上に保持している可能性を明らかにした。また様々なヘテロクロマチン形成変異株を用いた一分子FISH解析により、セントロメアncRNAが細胞質へと輸送される過程でsiRNAへとプロセスされている可能性を示した。更に、セントロメアコア領域から発現されるncRNAの機能を解明するため、prp14変異によるセントロメアヘテロクロマチン形成不全のサプレッサーを17株分離した。
ヒト培養細胞を用いた解析では、セントロメアncRNAと結合するDHX38とYB-1について解析を進め、DHX38については機能解析結果を論文として報告した。YB-1については、6箇所のリン酸化候補部位を活性化型（アスバラギン酸置換）もしくは不活性化型（アラニン置換）に変化させた変異体を多数作成し発現解析を行った。その結果、YB-1の102番目のセリン残基がリン酸化されることが、染色体分離制御のみならず細胞核の分葉化形成のトリッガーとなることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分裂酵母Ptr8pによるセントロメアncRNAのペリセントロメア領域への保持機構について解析が順調に進展した。ptr8変異のサプレッサーSec5とPtr8pや仲介因子Cbf11との結合は免疫共沈法によって検出できなかったが、RNA免疫共沈解析によりPtr8pがセントロメアncRNAに結合することでncRNAを染色体上に保持しヘテロクロマチン形成を促進している可能性が示された。また、dcr1などヘテロクロマチン形成変異株を用いた一分子RNA FISH解析で、セントロメアncRNAが細胞質へと輸送される過程でsiRNAへとプロセスされている可能性や二重鎖ncRNAとして細胞質へと移行される可能性を示した。更に、分裂酵母における細胞質と核の分画手法を確立し、変異株においてセントロメアncRNAが細胞質へと輸送されることを生化学的にも証明した。セントラルコア領域から発現されるncRNAの機能解析についてもサプレッサー候補を分離し解析を進めている。
ヒト培養細胞を用いた解析では、セントロメアncRNAと結合するDHX38の機能解析については論文(Genes to Cells)として報告した。YB-1については、ノックダウン解析で染色体分離制御及び核の形態形成に必要であることを明らかにした。また、6箇所のリン酸化部位を活性化型（アスバラギン酸置換）/不活性化型（アラニン置換）に変化させた変異体の発現解析の結果、YB-1の102番目のセリン残基のリン酸化が、染色体分離制御のみならず細胞核の分葉化形成にも必要不可欠であることを明らかにし、RNA結合タンパク質YB-1の染色体分離制御及び核の形態形成における新たな機能を解明できた。特にYB-1の核形態形成における機能は染色体の核内動態とも関連が深く、今後の解析結果に大変興味が持たれる。以上の結果から、おおむね研究は順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
分裂酵母mRNA核外輸送因子Ptr8pのセントロメアncRNAをペリセントロメア領域に保持する分子機構に関する解析は、ヘテロクロマチン形成不全に対するサプレッサー因子の解析を中心に継続する。RNA免疫共沈解析（RIP解析）系と分裂酵母における細胞分画（細胞質と核）を確立したので、それらを駆使して解析を進める。
ヒト培養細胞（HeLa細胞）を用いた解析では、令和2年度ではセントロメアncRNAと結合するYB-1の機能解析に注力する予定である。YB-1はCold shock domainと呼ばれるRNA結合ドメインなどいくつかの機能ドメインを保持しているので、それら機能ドメイン毎の染色体分離制御や核形態形成機構における機能解析を、遺伝子の該当部分断片を発現するプラスミドを構築して進めていく。最近、RNA-Seq解析により、YB-1とも相互作用する可能性のある、核形態形成の初期反応に関わると推定される8種類以上のncRNA（全てデータベース上では機能未知）を発見した。それらncRNA群の機能解析は、今までに報告例のない核形態と染色体構築に関わるncRNAの発見に繋がる可能性がある。今後、ノックダウン解析や過剰発現解析を含めて、それらncRNA群の分子機能の解析を鋭意進めていく予定である。
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