2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a shuttle vector which is autonomously replicable in chloroplast and E. coli
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17H03750
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
寺地 徹 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (90202192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山岸 博 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (10210345)
木村 成介 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (40339122)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 葉緑体 / 形質転換 / ベクター / タバコ / シャトルベクター / パーティクルボンバードメント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、葉緑体内で自律複製可能な葉緑体形質転換ベクターを新たに開発することにある。そのためまず、高等植物の葉緑体ゲノムの複製起点を同定した。本研究を開始する以前、高等植物の葉緑体ゲノムの複製起点は、oriA、oriBと呼ばれる特殊な配列であると考えられていた。しかし我々の先行研究の結果から、葉緑体ゲノムの複製起点はゲノム全域に多数散在して存在することが推定された。そこで、異なる葉緑体DNA断片を、抗生物質耐性遺伝子aadAのみを持つ大腸菌のプラスミドベクターにクローニングし、タバコの葉緑体に導入した。具体的には、葉緑体ゲノム全長の96％に相当する配列を持つ、77種類のプラスミドコンストラクトを作製し、これらのコンストラクトを3種類ずつ混合してタバコの葉へパーティクルボンバードメント法で導入した。その結果、抗生物質耐性を示すタバコが74個体得られた。植物全DNAのPCR解析及び大腸菌へのトランスフォーメーションの結果から、74個体のうち18個体について、撃ち込んだプラスミドがそのまま植物に維持されていることがわかった。プラスミドの種類は合計14種類であったので、これら14種類のコンストラクトは、葉緑体に導入されたプラスミドに自律複製能を与える葉緑体DNA断片を持つと結論された。続いて、上記14種類のコンストラクトの中から1種類（SX20と命名）を選び、外来遺伝子(gfp)を導入することが可能か検討した。SX20に、葉緑体で働くように加工したgfp遺伝子を組み込み、タバコの葉に導入した。その結果、10個体の抗生物質耐性個体が得られ、うち調査した１個体について、撃ち込んだコンストラクトがそのまま維持され、GFPが発現していることが確認された。以上の結果を総合して、本研究では葉緑体と大腸菌の双方で自律複製が可能なシャトルベクターを初めて開発することができたと結論した。
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| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
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