2020 Fiscal Year Annual Research Report
ハダニ類の大容量塩基配列解析によって得られた領域に基づいた超高速簡易識別法の確立
| Project/Area Number |
17H03775
|
|---|
| Research Institution | Ryutsu Keizai University |
|---|
Principal Investigator |
後藤 哲雄 流通経済大学, 経済学部, 教授 (60178449)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北嶋 康樹 茨城大学, 農学部, 准教授 (00431651)
坂本 洋典 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 研究員 (70573624)
粥川 琢巳 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (70580463)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ダニ・線虫管理 / 系統関係 / ゲノム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ハダニ類7属34種35系統(ナミハダニ属13種14系統、マルハダニ属4種、ツメハダニ属7種、マタハダニ属2種、アケハダニ属5種、クダハダニ属2種、ヒラタハダニ属1種)について、実験計画の「3.有効な簡易識別用プライマーの設計およびPCRの高速化」と「4.マルチプレックスPCRの最適化」に取り組んだ。前年度までにRNA－Seqを終えた35系統のうち23系統について、プライマー候補配列が含まれる遺伝子配列のアライメントデータを用い、候補配列と対になるプライマーを設計した。RNA-Seqデータをアセンブルしてできたコンティグにはイントロンが含まれないため、ゲノムDNAを用いて行うPCRでは塩基配列の長さに齟齬が生じる可能性がある。そこで主にイントロンレスの遺伝子のアライメントデータでプライマーを設計した23系統では、PCR反応の条件検討を行い、得られたPCR増幅産物の電気泳動において、増幅されるはずの種のみで想定される断片長のバンドが得られることを確認した。ただし、これらの種特異的プライマーセットを識別に用いる場合、識別したいハダニ1個体群に対して、最低でも23セットのプライマーを用いたPCRの実施が必須であるが、この大変な手間を避けるため、複数の種特異的プライマーセットを1つのチューブに混合し、増幅断片長で種の識別が可能なマルチプレックスPCRの条件検討を実施した。マルチプレックスPCR反応液に混合するプライマーセットの組み合わせのパターンとPCR反応条件を最適化することにより、1本のチューブで最大6種のマルチプレックスができることを確認した。さらに、DNA抽出時間削減のため、生きたハダニ1個体から直接、または1個体をホモジェナイズした液を使いマルチプレックスPCR法の検討を行い、最終的にハダニ11種12系統について、約1.5時間で種を同定する手法の確立に成功した。
|
| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
|
