2017 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on formation mechanism of nano-organelle in growing cells by live-cell time-lapse fluorescence imaging analyses.
| Project/Area Number |
17H03791
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
福森 義宏 金沢大学, その他部局等, その他 (60135655)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | イメージング / 磁性細菌 / 原核細胞 / オルガネラ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細菌に磁気感知という特性をもたらしているナノサイズの原核細胞オルガネラ「マグネトソーム」を細胞が生きた状態で可視化することにより、その形成過程の解明に取り組む。これまでマグネトソームの形成過程は、マグネトソーム局在蛋白質の個々の遺伝子欠損株を用いた電子顕微鏡観察結果の静止画的情報をもとに議論されてきた。本研究では、全反射蛍光顕微鏡などを用いて、生細胞内でのマグネトソーム形成機構を時空間的に解析する。本年度の研究実績は以下の通りである。
１、マグネトソーム形成初期段階の生細胞蛍光イメージングを行うため、マグネトソーム小胞形成の初期段階に必須とされるMamQ蛋白質とGFPの融合蛋白質を磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1細胞内に発現させ、MamQ-GFPによる生細胞蛍光イメージング実験系を構築した。また、mamQ遺伝子欠損株の作製を行なった。
２、GFP由来のpH感受性蛍光蛋白質をAMB-1細胞内に発現させ、顕微分光装置を用いて細胞のもつ蛍光スペクトルを測定することで、生きた細菌１細胞内のpHを調べた。マグネトソーム局在蛋白質とpH感受性蛍光蛋白質の融合蛋白質を用いて、マグネトソーム小胞内部のpHの測定に成功した。マグネトソーム小胞内部のpHは、磁鉄鉱合成の行われる対数増殖期特異的に増加することが明らかになった。この結果は、磁鉄鉱合成とマグネトソーム内pH変化との関連を示唆する。本研究は、マグネトソーム内のpHを測定する方法を世界で初めて開発したもので、研究成果を論文発表した（Biosci. Biotechnol. Biochem., 2018）。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に計画したMamQ-GFPによる生細胞イメージング系の確立、野生株、mamK欠損株でのマグネトソーム動態観察が完了した。本年度に計画したマグネトソーム形成過程を制御できる磁性細菌株の作製は、やや遅れており来年度での完成を目指す。一方、pH感受性蛍光蛋白質を用いた生細胞イメージングにより、マグネトソーム小胞内pH変化を観察できる実験系を世界で初めて構築した。本法では、マグネトソームの内部環境を１細胞レベルで非侵襲的、継時的に解析できることから、マグネトソーム小胞がもつ特異的機能である磁鉄鉱結晶合成のメカニズム解明への貢献が期待できる。以上のように、おおむね順調に進展しており（２）を選択した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
生細胞内でのマグネトソーム形成機構を時空間的に解析するため、mamQ欠損株を用いて、マグネトソーム形成過程を制御できる磁性細菌株を作製する。得られた株において、マグネトソーム形成に重要な機能を持つ蛋白質（MamQ, MamI, MamC, MamK, MamJ等）のマグネトソーム小胞形成時の細胞内動態を、生細胞蛍光イメージングにより観察することで、これらの蛋白質がどのようにマグネトソーム小胞形成に関わり、形成されたマグネトソームをどのように細胞内配置するかを解析する。観察には、全反射蛍光顕微鏡と高い感度と時間分解能をもつデジタルカメラ（ORCA-Flash4.0）（H30年度購入費を計上）を使用する。観察に高度な空間解像能が必要な場合は、超解像レーザー顕微鏡（TCS-STED）を用いて、詳細な局在を調べる。
一方、最近国外の研究グループが、分子生物学的手法によりMamB, E, I, Q, Lの５つのマグネトソーム蛋白質がマグネトソーム小胞形成に重要な機能を持つことを報告した。しかし、これらの蛋白質の細胞内局在や発現時期や発現量などの実態は不明である。そこで、これらの蛋白質を大腸菌で発現、精製する。得られた蛋白質を抗原として抗体を作成し、免疫組織化学的手法により、磁性細菌内でのこれらの蛋白質の詳細を調べる。また、精製したこれらの蛋白質と人工膜を用いて、膜小胞形成活性を検証する。
|
