2018 Fiscal Year Annual Research Report
Light regulation mechanism of ascorbate biosynthesis in plants
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17H03807
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
石川 孝博 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 教授 (60285385)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸田 隆典 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (50607439)
吉村 和也 中部大学, 応用生物学部, 准教授 (90379561)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アスコルビン酸生合成 / 光情報伝達 / シロイヌナズナ / 遺伝子発現 / リン酸化修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）VTC2 遺伝子の光応答性転写調節因子の探索と同定：繰越の要因となっていた変異原エチルメタンスルホン酸（EMS）処理を施したVTC2-prom::FLUC 遺伝子導入シロイヌナズナに対し自殖M2 種子ラインを得、研究分担者の中部大・吉村博士の所有する培養搬送装置付き高感度生物発光測定装置を用い、LUC活性を指標に再スクリーニングを実施した。その結果、約10000ラインから目的の複数のLUC発光の異常を示す変異株を単離できたため、さらに得られたホモ変異体種子を用いた２次スクリーニングを実施している。
２）アスコルビン酸によるVTC2フォスフォリラーゼ活性調節機構の解明：前年度に引続き、大腸菌においてGST融合タンパク質として組換え体VTC2を発現・精製し、VTC2活性におよぼす酸化型アスコルビン酸の分解物の影響を検証した。その結果、VTC2はシュウ酸により拮抗阻害を受けることが示され、反応速度論的解析を済ませた。
３）VTC3 の標的因子同定とリン酸化シグナル伝達系の解明：前年度のシロイヌナズナVTC3破壊株を用いたリン酸化プロテオーム解析の結果を受け、アスコルビン酸生合成経路を構成するVTC2およびGMEタンパク質に着目し、それらのリン酸化該当部位に変異を導入した擬似組換え体タンパク質を作出し、それらの酵素活性に及ぼす影響を評価した。その結果、VTC2およびGMEのリン酸化は酵素活性ではなく、同酵素の安定性に影響する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は、項目１のVTC2 遺伝子の光応答性転写調節因子の探索において、再スクリーニングの必要があったが、幸い今年度は期待した表現型を示す変異体複数を単離することができ、その分の遅れは挽回しほぼ当初計画に沿って進行している。また項目２ではVTC2活性調節に関わる酸化型アスコルビン酸分解物の同定およびその酵素学的解析が完了し、論文化の目処ができたこと、項目３ではVTC3によるリン酸化標的候補タンパク質として、アスコルビン酸生合成経路を構成するVTC2およびGMEに絞込み、それらの組換え体酵素による評価が進行していること、から概ね順調に進展していると自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の進捗状況を受け、各実施項目において今後は以下のように進める方策である。
１）VTC2遺伝子の光応答性転写調節因子の探索と同定：前年度までにLUC発光の異常を示す変異株を複数単離したため、二次スクリーニングの実施を継続し、目的の変異株の単離を早期に済ませる。単離した変異体の光応答性を詳細に解析するとともに、ゲノムリシークエンスによる原因遺伝子同定のための戻し交配を進めて行く方針である。
２）アスコルビン酸によるVTC2活性調節機構の解明：予定していたデータがほぼ取得できたため、論文化を進めてゆく。
３）VTC3標的因子同定とリン酸化シグナル伝達系の解明：VTC3によるリン酸化標的候補タンパク質として、アスコルビン酸生合成経路を構成するVTC2およびGMEに絞込みそれらの組換え体酵素による活性評価に引続き、安定性に及ぼす影響を精査する。また、VTC3の組換え体タンパク質を用意し、そのリン酸化/脱リン酸化活性の評価を32P等を利用して進めて行く方針である。
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[Journal Article] Chloroplast development activates the expression of ascorbate biosynthesis-associated genes in Arabidopsis roots.2019
Author(s)
Shiroma, S., Tanaka, M., Sasaki, T., Ogawa, T., Yoshimura, K., Sawa, Y., Maruta, T., Ishikawa, T.
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Journal Title
Plant Science
Volume: 284
Pages: 185-191
DOI
Peer Reviewed
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