2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of biosensor system for fish physiological state by using bidirectional communication technology
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17H03871
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
遠藤 英明 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (50242326)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | バイオセンサ / 魚類 / モニタリング / 通信 / 雌雄判別 / 産卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，双方向通信技術を用いて，遊泳している魚の生理状態を目視で容易に判別でき，かつ指標物質となる各種パラメーターを定量的にリアルタイムモニタリングできる新しいバイオセンシングシステムを創出することである．今年度は，魚類の生理状態を把握するための各種バイオセンサシステム（産卵時期予測，早期雌雄判別）の製作および，双方向通信回路の基本設計及び製作を行った．
まず，魚の産卵時期予測を可能にするためのバイオセンサの製作を試みた．魚類は，環境要因や生理学的要因により成熟・排卵時期が変動するが，排卵前に17α,20β-dihydroxy-4-pregnen3-one（DHP）を急激に分泌するため，これを指標とすることにより産卵時期の予測が可能であるといわれている．そこで，抗-DHP抗体とグルコースオキシターゼをディスク型金電極表面に固定化することにより，DHP測定用バイオセンサを作製した．また，電極反応における生体素子にグルコースオキシターゼを利用することにより，生体への毒性が極めて少ないバイオセンサを構築を試みた．
次に，未成熟状態の魚の雌雄判別を可能にするためのバイオセンサの製作を試みた．魚類の血中に含まれる11-Ketotestosterone（11-KT）の濃度は雌雄の間で大きく異なり，その雌雄判別の指標として用いられている．そこで，抗-11-KT抗体を自己組織化単分子膜（SAM）が形成されたディスク型金電極に固定化することにより，11-KT測定用イムノバイオセンサを製作した．
さらに双方向通信については，電波を伝達手段とした通信回路の設計を行い，バイオセンサによって得られた出力電流値を基に，PC上でLED点灯色の校正を双方向通信により行い，魚のストレス応答の大小に応じた点灯色の変化を検証した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
産卵時期予測のためのバイオセンサについては，DHP濃度7.8 ~ 500 pg/mlの範囲で測定が可能であり，血漿中に含まれると推測される他種ステロイドホルモン（コルチゾル，エストリオール，テストステロン）には反応せず，DHPの特異的検出が可能であった．そして，キンギョ血漿試料中のDHP濃度を測定したところ，その産卵時期予測が可能であることがわかった．
次に， 雌雄判別測定のためのバイオセンサについては，抗原抗体反応前後における電極表面の電気化学的微小変化をサイクリックボルタンメトリーで解析することで11-KTの定量を試みたところ，0.05 ~ 1.65 pmol/mlの範囲で測定が可能であった．また，実試料への適用として，ナイルティラピア（雄および雌）血漿試料中の11-KT濃度を測定し，従来法（ELISA）の測定値との相関を検討したところ，両者の間には良い相関関係が認められた（R = 0.9976）．
一方，設計・製作した双方向通信回路の作動については，PC上でLED点灯色の校正が可能であることが確認でき，次年度の研究計画に十分対応できることがわかった．前年度からのコルチゾル測定用小型フローシステムの試作については，改良が必要な項目が幾つか残っており，引き続き検討を重ねて行くこととした．
さらに，本研究成果の一部を2018年6月にアメリカ合衆国マイアミ市で開催された国際会議「Biosensors2018」において発表したところ，Poster Prize Winnerを受賞することができた．[発表題目：LED color-switching type wireless biosensor system for the visualization of fish stress]
以上の理由から，本研究の進捗状況は計画通り順調に進展していると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度において，双方向通信システムをほぼ完成させることができたので，平成31年度は実際にこれを魚体に装着して，複数の魚を遊泳させた状態でのストレス応答モニタリングを試みる．本システムは，バイオセンサによって得られたストレス応答の変動を，双方向通信により陸上端末（PC）に転送し，ストレス指標物質となるグルコースの濃度を測定する原理に基づいている．まず，試験魚となるナイルティラピアに，双方向通信回路とバイオセンサを装着し，魚を遊泳させた状態で魚体上のLEDの点灯・消灯の作動を検証する．次に，本システムを複数の個体に各々装着し，水槽内で対面させることにより，各個体のストレス応答をモニタリングすると同時に，複数の魚の中から目的とする個体を双方向通信により識別することを試みる．
一方，これまではバイオセンサを魚体に装着する際に，血中グルコース濃度との相関関係が確認されている魚類眼球外膜間質液（EISF）中にセンサを留置してきた．しかしながら，EISFの存在が確認されている魚種はそれほど多くなく，システムの適用が限定されていた．そこで次年度は，新たな留置場所として魚の腹腔中の腹水に着目し，ストレス応答モニタリングの可能性を検討する．まず，ナイルティラピアの腹腔から腹水を採取し，比色定量法によりそのグルコース濃度を測定し，実際の血糖値との相関関係を調べる．そして，両者の間に良い相関性が認められたら，魚の腹腔内にセンサを留置し，魚を遊泳させながら一定のストレスを負荷し，そのストレス応答モニタリングの実現を試みる．
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