Single cell応答に基づく原虫病研究の基盤構築と有用性の評価

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03912
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 山岸 潤也 北海道大学, 人獣共通感染症リサーチセンター, 准教授 (80535328)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 穣 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 教授 (40323646)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: シングルセル / トランスクリプトーム / 原虫

Outline of Annual Research Achievements

現在、１細胞のトランスクリプトームを1万個以上同時に取得する技術が利用可能となっている。この新規技術は一般にガンや免疫応答の解析において先行して利用されているが、原虫そのものの応答や、原虫―宿主細胞の応答をトランスクリプトームから解析する試みはまだ行われておらず、新規かつ特異的な知見が得られる可能性が期待できる。
そこで本プロジェクトでは、この飛躍的な技術革新を原虫病研究に適用し有用性を評価するための実証試験を提案した。具体的には各種原虫（Trypanosoma, Toxoplasma, Plasmodium）、各種実験系（in vitro培養実験, in vivo感染実験）を対象とし、段階的に困難・複雑な系に挑戦することで着実にノウハウを蓄積し、当該分野での基盤形成を目的とする。
初年度にあたるH29年度は、BioRad社のddSEQ Single-Cell Isolatorデモ機を調達し、トリパノソーマ原虫をモデルケースにシングルセルトランスクリプトーム系の確立を試みたが、ライブラリーの構築は失敗に終わった。本系は非常にシンプルである反面、失敗時にトラブルシュートを行う点が少ないことが問題であった。さらに、トラブルシュート自体にも大きなコストが生じるため、少なくとも線形かつ運動性を有するトリパノソーマ原虫には適さない系であることが示唆された。シングルセル用のライブラリー構築システムには、BioRad社ddSEQ Single-Cell Isolatorの他、10x genomics社製のChromiumが利用できる。今後はこれらの利用を視野に入れて研究を再構築する必要がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

BioRad社ddSEQ Single-Cell Isolator のデモ機を用い、Trypanosoma bruceiを材料に、シングルセルシーケンスライブラリーの構築を行った。BioRad社Single-Cell Isolatorは、デイスポーザブルなマイクロ流路デバイスにより１細胞を含むドロップレットを作成することに特徴を有し、10x genomics社製のChromiumよりランニングコストが安いことを特徴とする。培養T bruceiを氷冷、ストレーナーで単細胞のみを取得し、機器インストラクションマニュアルに従ってライブラリーの構築を試みたがライブラリーの取得は達成できなかった。１回の実験に数十万円を要することから、コントロール実験にて系の動作確認をすることは断念した。一般に球状である一般の細胞に比べ、トリパノソーマ原虫は線形で、さらに、運動性を有することも失敗の一因であると考えられる、また、その他のトラブルシュートについても、機器内での進行が不可視なため段階的な進捗確認が行えない難点があり、これ以上の試行錯誤も断念した。

Strategy for Future Research Activity

H31年度は、運動性を有するトリパノソーマ原虫を一時凍結し、トキソプラズマ原虫の解析に移行する。また、ライブラリー構築システムは、現在主流の10x genomics社製のChromiumをメインに、インクジェットプリンターの原理で微細なバイオ材料の吐出を可能とするMicroJet社のマテリアルプリンターを利用した独自系の開発も視野に入れる。また、他研究者との共同研究により、標準的なマウスPBMCシングルセル解析を行うことで、系の習得を図る。加えて、公開されているシングルセルデーターを用い、後段のバイオインフォマティクス解析関連の技術取得を図る。以上のバックアップにより、初年度のつまずきのリカバーを図る。