Generation of African swine fever and highly pathogenic PRRS-resistant pig by genome editing of CD163

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03916
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学研究院, 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大竹 正剛 静岡県畜産技術研究所, 中小家畜研究センター 養豚・養鶏, 上席研究員 (90605677)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / CD163 / 豚繁殖・呼吸障害症候群 / マイクロミニピッグ / 体細胞クローン

Outline of Annual Research Achievements

アフリカ豚コレラ（ASF）や豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、多様な抗原性を示すウイルスによる感染症であり、有効なワクチンの開発は極めて困難である。本研究課題では、そのような感染症の新たな制圧方法として、遺伝子改変技術によるAFSおよびPRRS抵抗性ブタの開発を目的に、先ず、CRISPR/Cas9システムを利用して、両ウイルスのレセプター分子であるCD163を本来のスカベンジャー機能は保存し、レセプター機能を削除するゲノム編集により両ウイルスに対する感染抵抗性を付与した細胞株を樹立する。次に、ゲノム編集細胞の核移植による体細胞クローン技術により、ASFおよびPRRS抵抗性MMPを作製することを目的とする。平成29年度は、以下のような成果が得られた。
1. ゲノム編集マイクロミニピッグ（MMP）胎仔線維芽細胞（PEF）株の樹立にピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを使用するとプラスミド配列のブタゲノムへの導入が起こり、体細胞クローンを作製するに当たり、予期せぬ副作用が生まれる可能性があったので、プラスミドに変えて、sgRNA、Cas9蛋白およびピューロマイシン抵抗性DNA断片を使用する方法を確立した。
2. 1の方法により、抗ウイルス作用が期待される可溶型CD163を発現するゲノム編集MMP PEF株を樹立した。
3. PRRSウイルスに対するレセプター活性を有するCD163の５番目のScavenger receptor cysteine-rich （SRCR5）ドメイン内のレセプター活性に重要と考えられるアミノ酸に点変異を導入するためのプラスミドおよびゲノム編集用sgRNAを構築した。
4. MMPのPEFのiPS細胞への誘導では、ES細胞様の形態を有する細胞を樹立したが、初期化因子としては、Oct-4AおよびSox2の発現を確認するに留まっている。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

1. ブタの遺伝子データベースにCD163遺伝子のlocusおよび全塩基配列が存在しておらず、CD163の各SRCRドメインを欠失させるためのイントロン配列が不明であったことからゲノム編集に使用される各種プラスミドの構築が遅れた。
2. ゲノム編集MMP PEF株の樹立にピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを使用するとプラスミド配列のブタゲノムへのランダムな導入が起こり、体細胞クローンを作製するに当たり、予期せぬ副作用が生まれる可能性があったので、プラスミドに変えて、sgRNA、Cas9蛋白およびピューロマイシン抵抗性DNA断片を使用する方法を検討するために時間を要した。
3. MMP PEFのiPS細胞への誘導に時間を要している。
以上の理由から、計画よりも遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

1. 平成29年度に引き続きMMPのPEFのCD163遺伝子のゲノム編集を実施する。外来遺伝子の導入を避けるため、エレクトロポレーションには、ゲノム編集用プラスミドに代えて、Cas9タンパク質、sgRNAおよびピューロマイシン抵抗性DNA断片を使用する。
2. ゲノム編集細胞の確認は、樹立した細胞株からDNAを抽出し、切断部位の上流と下流のプライマーを用いて、PCRで増幅し、塩基配列の解析により遺伝子の変異を確認する。
3. ブタ受精卵にゲノム編集用遺伝子導入装置を使用して、Cas9タンパク質とsgRNAをエレクトロポレーションする。ゲノム編集の確認は、2と同様に実施する。
4. PEFに市販のHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mix （TAKARA）をHuman Dermal Fibroblast Nucleofector Kit（TAKARA）を用いて、エレクトロポレーションし、Cellartis DEF-CS 500 Culture System（TAKARA）を用いて培養し、遺伝子導入細胞からiPS細胞を誘導する。
5. iPS細胞の未分化能の確認は、ES細胞様の形態とアルカリフォスファターゼ染色陽性であること、および核初期化因子の発現をRT-PCR、蛍光抗体法およびウエスタンブロット法で確認する。
6. ゲノム編集PEF由来体細胞クローン胚を仮親ブタに移植し、CD163ゲノム編集MMP体細胞クローン個体を作出する。