Generation of African swine fever and highly pathogenic PRRS-resistant pig by genome editing of CD163

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03916
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学研究院, 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大竹 正剛 静岡県畜産技術研究所, 中小家畜研究センター 養豚・養鶏, 上席研究員 (90605677)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / CD163 / 豚繁殖・呼吸障害症候群 / マイクロミニピッグ / アフリカ豚コレラ

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、CRISPR/Cas9システムを利用して、アフリカ豚コレラおよび豚繁殖・呼吸障害症候群抵抗性ブタの開発を目的とする。
1. 平成30年度に引き続き、マイクロミニピッグ（MMP）の胎仔線維芽細胞（PEF）を用いて、CD163の本来のスカベンジャー機能は保存し、レセプター機能を削除するために、CD163の５番目のScavenger receptor cysteine-rich （SRCR5）ドメインのレセプター活性に関与する３つのアミノ酸に点変異を導入するためのssDNA及びレセプター活性のないマウスのSRCR5のアミノ酸配列に置換するためのssDNAとSRCR5内の３ヶ所を切断する3種類のsgRNAを用いてゲノム編集を実施したが、目的の細胞株を樹立することは出来なかった。
2. PEFからのiPS細胞への誘導を試みるため、エピソーマルベクターに代えて、レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター+エピソーマルベクター及びレトロウイルスベクター+フィーダー細胞の異なる方法で実施したが、何の場合もES細胞様コロニーは出現するが細胞のクローニング後の増殖に成功しなかった。また、アルカリフォスファターゼ染色は、陰性であった。
3. MMPの受精卵を用いて、2回のゲノム編集実験を実施した。1で使用した3種類の合成sgRNAおよび2種類のSRCR5にアミノ酸変異を導入するためのssDNAとCas9蛋白質をマイクロインジェクションにより、MMPの受精卵前核に注入後、仮親ブタに移植した。1回目は、3頭の雌MMPから採卵し、計17個の受精卵にマイクロインジェクションし、仮親ブタに移植したが、妊娠は確認されなかった。2回目は、5頭の雌MMPから採卵し、計32個の受精卵にマイクロインジェクションし、生存した20個の受精卵を仮親ブタに移植した。今後、ゲノム編集MMPの誕生が期待される。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。