2019 Fiscal Year Annual Research Report
Production of genetically modified pigs by combined techniques of chromosome engineering and genome editing
| Project/Area Number |
17H03938
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
音井 威重 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (30311814)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹本 龍也 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (30443899)
香月 康宏 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90403401)
谷原 史倫 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 特任助教 (90754680)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | ゲノム編集 / 人工染色体 / ブタ / 異種移植 / GalT / HLA A24 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ドナー不足を解消する手段としてブタの臓器・組織を用いる異種移植に関心が高まっている。しかし、移植後１週目以降の急性・慢性拒絶反応による臓器機能不全を克服しなければならない大きな課題がある。本研究は、遺伝子搭載サイズに制限がない人工染色体技術と、任意のゲノムを部位特異的に切断し変異を挿入（ノックアウト）できるゲノム編集技術を組み合わせて、拒絶反応の少ない異種移植用の遺伝子改変ブタを作製することを目的とした。実際には、日本人に多いヒトHLA A24遺伝子を人工染色体で挿入し、かつ異種抗原であるGal転移酵素遺伝子をノックアウトすることにより、拒絶反応の少ない異種移植用のHLA 挿入GalT-KO ブタを作出する。本年度は、複数のｇRNAを用いたGEEP法によるゲノム編集が可能かどうか検討した。GalT遺伝子のほか、異種抗原の一つであるHD抗原の生成を担うCMAH遺伝子、さらにGHR、PDX1の4種類の遺伝子をターゲットとし、GEEP法により同時に受精卵へ導入し、発生した胚盤胞におけるゲノム編集程度を検討した。その結果、1遺伝子変異を持つ受精卵が65%、2遺伝子変異を持つ受精卵が10%と３遺伝子以上の変異を持つ受精卵は認められなかった。一方、ヒトHLA遺伝子群を搭載したヒト人工染色体ベクターをブタ線維芽細胞に微小核細胞融合法を用いて導入したところ、38クローンの薬剤耐性クローンが獲得できた。細胞をパッセージして増殖性がみられたクローンは32クローンであり、それらから細胞ストック作製とDNA抽出を行った。その中でも特に増殖能の高い11クローンのDNAを鋳型にして、HLA領域特異的プライマー（9種類）を用いて、PCR解析を行ったところ、11クローン中9クローンがHLA領域陽性であった。
|
| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
