2018 Fiscal Year Annual Research Report
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17H03968
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
椎名 隆 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (10206039)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野村 裕也 岐阜女子大学, 家政学部, 准教授 (00547028)
熊崎 茂一 京都大学, 理学研究科, 准教授 (40293401)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | カルシウム / 葉緑体 / ミトコンドリア / 気孔 / レトログレードシグナル / 感染防御応答 / ROS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カルシウム(Ca2+)は、気孔制御や感染防御応答、傷害応答などなど、植物の様々な細胞応答で重要な細胞内シグナルとして働く。フェラジェリンペプチド（flg22）などの病原体特異的分子パターンやアブシシン酸などは、細胞質ゾルCa2+濃度の一過的上昇を起こし、引き続き気孔閉口が生じる。しかし、植物細胞のCa2+シグナルの発生機構や制御機構については、多くのことがわかっていない。また、植物細胞のCa2+制御における葉緑体やミトコンドリアなどのオルガネラの役割についても、知見は少ない。これまでに、葉緑体チラコイド膜に局在するCa2+結合タンパク質CASに注目し、植物免疫応答における防御遺伝子発現制御や気孔制御における役割を解析してきた。2017年度の研究で、CASによる気孔免疫応答の制御に、細胞膜ROS生成酵素RbohDが関わる可能性を示すとともに、CASのリン酸化が光依存的気孔開口と関係することも見いだした。2018年度は、引き続きCASを中心に、気孔制御における葉緑体の役割を解析し、葉緑体によるCa2+制御の可能性を検討した。その結果、CASが病原体感染応答に伴う気孔閉口に特異的に関与しており、その制御には葉緑体レトログレードシグナルによるサリチル酸誘導制御が関係することを明らかにした。また、CASの脱リン酸化による気孔閉口に、細胞膜アニオンチャネルが関係する可能性を示した。さらに、flg22が誘導する気孔免疫応答に、細胞膜Ca2+チャネルのCNGC5が関わる可能性も明らかにした。接触刺激応答については、RbohFの働きと遺伝子発現制御の関係を中心に解析した。また、ミトコンドリア機能阻害が誘導する核遺伝子発現の制御にCa2+シグナリングが関与する可能性も示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）気孔制御における葉緑体の役割の解析： CASによる気孔免疫制御の分子機構を探るために、flg22処理後30分の初期応答遺伝子をRNAseqによって解析し、CASに依存するflg22初期応答遺伝子群を同定した。その結果、CASがSA合成関連遺伝子の発現誘導に関係することが明らかになった。この結果から、CASがレトログレードシグナルを介してSA合成遺伝子発現を誘導し、その結果生じたSAが気孔閉口を引き起こす可能性が示された。気孔免疫応答に先立って細胞質Ca2+シグナルが生じるが、それに関わるCa2+チャネルは同定されていない。今回、細胞膜Ca2+チャネルのCNGC5が気孔免疫応答に関係することを明らかにした。また、CASリン酸化による気孔制御については、CASのリン酸化に関わるSTN8のノックアウト変異体と、CASの非リン酸化変異体T380Aにおいて、光照射による気孔開口が抑制されていることを見出した。また、アニオンチャネルの特異的阻害剤の9-ACによって変異体の気孔閉口が抑制されることから、CASの脱リン酸化による気孔閉口に、アニオンチャネルの活性化が関わる可能性が示された。
（２）植物の接触刺激応答とROS： 接触刺激を受けた組織で、免疫応答遺伝子群の発現誘導に先立ってCa2+シグナルの発生とROS生成が起こるが、ROS生成は遺伝子発現制御に直接関わっていないことが明らかになった。
（３）ミトコンドリアによる細胞質Ca2+制御： RNAseq解析から、ミトコンドリア阻害で誘導される防御・ストレス応答遺伝子の多くの発現誘導がCa2+依存であることを見出した。また、ミトコンドリア阻害によるCa2+応答は、細胞外からのCa2+流入を阻害することで強く抑制されることから、ミトコンドリアが何らかのシグナルを介して細胞膜のCa2+チャネル制御をしている可能性が示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）気孔制御における葉緑体の役割の解析： 今年度の研究から、植物免疫応答において、葉緑体タンパク質CASがレトログレードシグナルを介してSA合成遺伝子群の発現を制御し、生じたSAが気孔閉口を引き起こす可能性が示された。今後は、SA合成遺伝子群の活性化に先立って起こるROS生成やCa2+応答とレトログレードシグナルとの関係の検証、およびCASが関係するレトログレードシグナルの実態解明にも取り組む。また、孔辺細胞のCa2+応答とCASの関係を細胞レベルで明らかにするために、蛍光Ca2+センサータンパクを用いた解析を進める。
これまでに、気孔免疫応答に関わるCa2+チャネルの候補としてCNGC5を同定した。CNGC5が気孔免疫応答に果たす役割を詳細に検討するとともに、その活性化機構についても解析を進める。また、気孔免疫応答に先立つCa2+シグナル形成に果たす役割についても、蛍光Ca2+センサーによる細胞レベルでの解析を進める。
光依存的CASリン酸化による機構制御の可能性については、細胞膜アニオンチャネルのslac1変異体との二重変異体を作成し、CAS脱リン酸化によるSLAC1活性化の可能性を探る。また、CASの脱リン酸化に関わる葉緑体脱リン酸化酵素の同定にも取り組む。
（２）植物の接触刺激応答とROS： 接触刺激によるCa2+応答とROS応答の関係を時空間的に明らかにするために、蛍光Ca2+センサーを用いたCa2+濃度変化とROS生成の同時測定にも取り組む。
（３）ミトコンドリアによる細胞質Ca2+制御： ミトコンドリア機能阻害による細胞質Ca2+シグナル発生に関わるCa2+チャネルの同定を進める。
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[Journal Article] The Cacao plantation in Sulawesi Island – Indonesia: ;Characterization of the soil microbial community.2019
Author(s)
I Negah Suwastika, Andre; Freire Cruz, Nurul Aisyah Pakawaru, Wahyuningsih Wijayanti, Muslimin, Zainuddin Basri, Yoko Ishizaki, Tetsushi Tanaka, Naoaki Ono, Shigehiko Kanaya, Takashi Shiina
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Journal Title
urasian Soil Science
Volume: 印刷中
Pages: -
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] The Cacao plantation in Sulawesi Island, Indonesia:I an agro-ecological analysis of conventional and organic farms2018
Author(s)
Andre; Freire Cruz, I Nengah Suwastika, Hayao Sasaki, Tomoharu Uchiyama, Nurul Aisyah Pakawaru, Wahyuningsih Wijayanti, Muslimin, Zainuddin Basri, Yoko Ishizaki, and Takashi Shiina
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Journal Title
Organic Agriculture
Volume: 9
Pages: 225-234
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A Ycf2-FtsHi Heteromeric AAA-ATPase Complex Is Required for Chloroplast Protein Import2018
Author(s)
Kikuchi S, Asakura Y, Imai M, Nakahira Y, Kotani Y, Hashiguchi Y, Nakai Y, Takafuji K, Bedard J, Hirabayashi-Ishioka Y, Mori H, Shiina T, Nakai M
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Journal Title
Plant Cell
Volume: 30
Pages: 2677-2703
DOI
Peer Reviewed
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