2019 Fiscal Year Annual Research Report
アポリポタンパク質の構造異常によるアミロイド線維形成の分子機構解明と制御法の開発
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17H03979
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| Research Institution | Kyoto Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
斎藤 博幸 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (60300919)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 薬学 / 生物物理化学 / 蛋白質 / 脂質膜 / 抗体 / アミロイドーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、血中や脳内でのコレステロール輸送を制御しているアポリポタンパク質のアミロイド形成機構の分子論解明を目的として、アミロイド線維形成過程の速度論的・熱力学的解析と共に、脂質や糖鎖等の体内因子による線維形成・臓器選択的沈着・毒性発現メカニズムに関する生化学的・細胞生物学的解析を行う。さらに、アミロイド線維の高感度検出法と形成制御・代謝回転促進技術の開発に向けた新規アミロイド抗体の開発や天然由来化合物の探索を行うことで、アミロイドーシス疾患の新たな診断・治療法開発のための科学的基盤構築を目指している。
令和元年度は、臓器や組織において様々なアミロイド線維との共沈着が報告されているアポEタンパク質について、in vitroでのアポA-Iアミロイド形成に対する効果の検証を行った。低濃度のアポE3はアポA-I 1-83フラグメントのβ構造転移・線維形成を促進する一方、高濃度のアポE3存在下ではβ構造転移はみられず、球状の凝集体のみが形成された。この際、アポE3とアポA-I 1-83フラグメントの分子間で蛍光共鳴エネルギー移動が観察されたことから、アポE3はアポA-Iの凝集・核形成段階に直接関与することで、アポA-Iアミロイド線維形成を制御していると考えられた。
また、平成29年度に開発したアポA-Iアミロイド線維を特異的に認識する４種類のモノクローナル抗体について、種々のアミロイド線維に対する反応特性を解析したところ、パーキンソン病原因タンパク質であるαシヌクレイン線維に対しても反応性を示したことから、アミロイド線維全般に共通の構造を認識していることが示唆された。さらに、培養細胞や疾患組織部位でのアミロイド線維高感度検出を目的とした高感度イムノアッセイ系の構築や、バイオイメージングへ適用可能な蛍光タンパク質融合一本鎖Fvフラグメント（ScFv）の作製を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脳内HDLの主要タンパク質であるアポEは、その遺伝多型（アイソフォーム）がアルツハイマー病発症危険因子として注目され、アミロイドβとの相互作用が広く研究されているが、様々なアミロイドタンパク質線維との臓器や組織における共沈着が報告されており、体内環境でのアミロイド沈着促進/抑制因子として注目される。本年度は、アポA-Iアミロイド形成におけるアポEの効果を検証した結果、アポE3はアポA-I分子と直接相互作用することでアポA-Iアミロイドの核形成を促進する一方、その線維伸長を阻害することを初めて明らかにした。これは、近年報告されたアミロイドβの凝集・線維形成過程に対するアポEの効果（FEBS J. in press）と一致する結果であり、アポEがアルツハイマー病のみならず全身性アミロイドーシスにおけるアミロイドタンパク質の凝集・沈着にも関与していることを示唆する。今後は、さらに細胞表面糖鎖環境下でのアポA-Iアミロイド形成に対するアポEの関与を明らかにすることで、生体内夾雑環境下でのアポリポタンパク質アミロイド形成の分子機構解明に迫りたい。
また、平成29年度に開発したアポA-Iアミロイド線維構造特異抗体の高感度イムノアッセイ系の構築を進めるとともに、その反応特性解析を行った結果、パーキンソン病原因タンパク質αシヌクレイン線維に対しても反応性を示すことが明らかとなり、アミロイド線維全般に共通の構造を認識する汎用性の高い構造特異抗体である可能性が示された。現在、これらの研究成果を国際学術誌に論文投稿中であるが、今後、in vivoイメージングへの適用やアポA-Iアミロイドーシス疾患に対する早期診断法への応用などが期待される成果である。
以上のように、当初の研究計画に対しておおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である令和2年度は、アミロイド共存タンパク質アポEによるアミロイド沈着促進/抑制メカニズムの解明を目的として、アポA-Iやαシヌクレインなどのアミロイドタンパク質の線維形成過程や動的構造安定性、脂質や糖鎖との相互作用におけるアポEのcofactorとしての関与を明らかにする。その際、野生型であるアポE3に加え、アルツハイマー病発症危険因子であるアポE4アイソフォームやそれらの疾患関連変異の影響も検討する。さらに、細胞表面糖鎖を足場としたアミロイドタンパク質の凝集・線維化、細胞内取込み・代謝過程におけるアポEの関与を明らかにすることで、生体内夾雑環境下でのアポリポタンパク質アミロイド形成の分子機構解明に迫る。
また、アポリポタンパク質アミロイド線維の形成制御・代謝回転促進技術の開発を目的として、ポリフェノール類であるEGCG誘導体やグリコシド、トリテルペノイド類などの天然由来化合物のin vitroスクリーニングからアミロイド線維形成阻害・脱会合作用を示す化合物を選定する。さらに、得られた候補化合物のアミロイド線維細胞毒性軽減効果をヒト培養細胞を用いて検証することで、アミロイド生成（アミロイドゲネシス）を標的とした新規治療薬候補化合物の探索を進める。
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[Journal Article] Mechanisms of Aggregation and Fibril Formation of the Amyloidogenic N-terminal Fragment of Apolipoprotein A-I2019
Author(s)
Mizuguchi C., Nakagawa M., Namba N., Sakai M., Kurimitsu N., Suzuki A., Fujita K., Horiuchi S., Baba T., Ohgita T., Nishitsuji K., and Saito H.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 294
Pages: 13515-13524
DOI
Peer Reviewed
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