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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Study of human brain barrier transport mechanism based global and targeted proteomics

Research Project

Project/Area Number 17H04004
Research InstitutionTohoku University

Principal Investigator

寺崎 哲也  東北大学, 薬学研究科, 教授 (60155463)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 立川 正憲  東北大学, 薬学研究科, 准教授 (00401810)
内田 康雄  東北大学, 薬学研究科, 助教 (70583590)
Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords血液脳関門 / 血液脳脊髄液関門 / 血液くも膜関門 / 血液脊髄関門 / 輸送担体 / 網羅的プロテオミクス / 標的プロテオミクス
Outline of Annual Research Achievements

脳には、1)血液脳関門、2)血液脳脊髄液関門、3)血液くも膜関門、4)血液脊髄関門があり、各々大脳毛細血管内皮細胞、脈絡叢上皮細胞、くも膜上皮細胞、脊髄血管内皮細胞が実体である。本基盤B研究ではヒトのこれら脳関門の物質輸送機構を解明することを目的とする。ブレインバンクから高品質の凍結保存されたヒト大脳、脳室脈絡叢、くも膜、脊髄を提供いただき、各脳関門細胞を単離し、細胞膜と細胞内画分を調製し、次世代型の網羅的半定量的探索質量分析法(SWATH)と、代表者らが開発したin silico設計法に基づく標的絶対定量質量分析法を用い、新規を含む機能性タンパク質の探索・同定・絶対定量を行う。機能未知の輸送担体候補タンパク質は発現系を構築し、メタボローム法で基質を同定し、機構解明する。これらを期間全体の3年間で達成する。
初年度は、貴重なヒトサンプルでの解析の前段階として、ブタを用いて大脳から高純度の毛細血管を単離する方法、左右側脳室と第三脳室と第四脳室から脈絡叢を単離する方法、大脳皮質4領域と脊髄3領域に分けて各々からくも膜を多く含軟髄膜を単離する方法、脊髄を3領域に分けて毛細血管を単離する方法を確立した。さらに、各サンプルについてSWATH法を用いて半定量的網羅的タンパク質発現解析を行った結果、各関門における輸送担体の発現に量的質的な顕著な違いがあることが分かった。従来、くも膜は単なる物理的障壁と信じられてきたが、非常に多種類の輸送担体が多量に発現することが分かった。当初計画にしたがって、ヒトの凍結大脳から毛細血管を単離したが、ブタで確立した手法では極めて純度が悪い結果が得られた。そこで、方法を根本的に見直し高純度に単離する方法を確立することができた。ガラスビーズ法を最終段階で導入することで血球細胞の混入を劇的に低下させることができた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ヒト凍結大脳からの脳毛細血管単離方法が、ブタで確立した方法では純度が極めて低いことが開始6ヶ月後に判明した。その後、4ヶ月掛けて根本的に単離法を見直し、高純度に単離する条件を確立することができた。
くも膜についてはブタで検討したところ、大脳皮質領域と脊髄領域では軟髄膜重量当たりのくも膜上皮細胞マーカータンパクの含有量が顕著に異なることが判明した。これは部位によって機能性タンパク質の発現量が異なるのか、あるいはくも膜上皮細胞の占める割合が異なるのか、区別ができないことになる。そこで、この課題を克服するための手法を開始10ヶ月目から行ったところ、初年度末にほぼ確立することができた。
質量分析についてはSWATH法で非常に重要なペプチドデータベース構築法をさらに改善し、解析結果の信頼性を向上させることに成功した。
以上、研究結果の信頼性の向上に非常に重要な実験条件を初年度に徹底的に見直して改善することができたことから、二年目以降には計画の遅れを取り戻して、成果を得る計画である。

Strategy for Future Research Activity

初年度はブタ組織を用いて技術的課題を解決し4種の関門についてプロテオミクス解析を行い、関門間と部位間で質的量的な大きな違いを見出したことから、ヒト組織での解析の重要性が示された。ヒトの凍結大脳から高純度の毛細血管を単離する方法を確立し、プロテオミクス解析に着手したことから、2年目はヒト脳毛細血管、脈絡叢、軟髄膜を用いたSWATH解析を行うと共に標的プロテオミクス解析を行い関門間と部位間での質的量的な違いを解明する。
特に、脳毛細血管については,、既に私達が標的プロテオミクスの手法を用いて報告済の輸送担体以外に今回は高感度化法とSWATH法の併用によって新しいタンパク質を発見することが見込まれる。
脊髄についてはブタで確立した方法とヒト大脳で確立した毛細血管単離手法を組み合わせて最終年度に解析を行う予定である。
輸送機能を解明するためにメタボロームの手法を確立し、最終年度にはこの手法を用いて関門の輸送機能解明研究を推進する予定である。

Research Products

(9 results)

All 2018 2017

All Journal Article Presentation

  • [Journal Article] 脳脊髄液中物質動態における脳脊髄液と接する関門の役割:脈絡叢上皮細胞、クモ膜上皮細胞、脊髄毛細血管内皮細胞における細胞膜輸送2017

    • Author(s)
      張正宇、立川正憲、寺崎哲也
    • Journal Title

      神経内科Neurological Medicine

      Volume: 87 Pages: 253-263

  • [Presentation] ラット血液脊髄関門と血液脳関門におけるトランスポータータンパク質発現量の類似性と相違性の解明2018

    • Author(s)
      八木悠太、内田康雄、立川正憲、寺崎 哲也
    • Organizer
      日本薬学会第138年会
  • [Presentation] SWATH及び高精度ペプチド選択を組み合わせた膜タンパク質のApical/Basolateral膜局在と絶対発現量の網羅的推定法の開発2018

    • Author(s)
      平野誠巳、内田康雄、立川正憲、後藤諒平、寺崎哲也
    • Organizer
      日本薬学会第138年会
  • [Presentation] ブタ脈絡叢と脳軟髄膜の網羅的・標的プロテオミクス解析:OATP1A2、OCT2及びMATE1の発現局在とCSF中薬物動態における役割2018

    • Author(s)
      後藤諒平、内田康雄、立川正憲、平野誠巳、張正宇、寺崎哲也
    • Organizer
      日本薬学会第138年会
  • [Presentation] Pharmacoproteomics (PPx) of the CNS Barriers: Recent Progress and Prospect2017

    • Author(s)
      Terasaki T
    • Organizer
      Allen J. Sedman Lecture Award in Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, USA
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 標的定量質量分析法に基づくクモ膜上皮細胞と脈絡叢上皮細胞の有機アニオントランスポータータンパク質の解析:脳脊髄液中薬物動態における役割評価2017

    • Author(s)
      張正宇、立川正憲、内田康雄、寺崎哲也
    • Organizer
      第39回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • [Presentation] Development of label free comprehensive absolute quantification method by SWATH-MS combined with in silico peptide selection criteria : Its application for the hepatic drug delivery2017

    • Author(s)
      平野誠巳、内田康雄、立川正憲、後藤諒平、寺崎哲也
    • Organizer
      日本薬物動態学会第32回年会
  • [Presentation] OUTER blood-CSF barrier (arachnoid membrane) abundantly expresses OAT1, OAT3, PEPT2 and BCRP proteins as compared to INNER blood-CSF barrier (choroid plexus)2017

    • Author(s)
      後藤諒平、内田康雄、立川正憲、平野誠巳、張正宇、寺崎哲也
    • Organizer
      日本薬物動態学会第32回年会
  • [Presentation] Proteomics based characterization of the blood-spinal cord barrier transporters in rats: Comparison with the blood-brain barrier2017

    • Author(s)
      八木悠太、立川正憲、内田康雄、寺崎哲也
    • Organizer
      日本薬物動態学会第32回年会

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Published: 2018-12-17  

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