2017 Fiscal Year Annual Research Report
Reconstitution physiology: Functional construction of channel and membrane
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17H04017
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
老木 成稔 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (10185176)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩本 真幸 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (40452122)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 脂質二重膜 / 膜張力 / 機械受容性チャネル / コレステロール / インビトロ転写ー発現系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チャネルと膜の機能的構築を、私達が新しく開発した脂質平面膜法（Contact bubble bileyer: CBB）により行い、チャネル－膜相互作用を明らかにすることをとおして生体類似膜を再構成することが目的である。
新しい膜灌流法によってKcsAカリウムチャネルがコレステロールによって活性を失うことを初めて発見した。この効果は可逆的であった。コレステロールには類縁物質が多数存在するが、それらの物質もチャネル活性を抑制することが明らかになり、これらの結果はチャネルとコレステロールが化学的結合によってではなく、他の要因によって作用することを示唆した。一方で私達は膜の物理的な張力を測定する方法を開発した。この方法により、膜にコレステロールが入ってくると、膜張力が減少することを初めて明らかにすることができた。これらの成果は現在、メジャージャーナルに投稿中である。
これらの方法は膜界面化学の成果を利用したものであり、現在、膜張力と膜の厚さの変化を測定することができる新しい方法を確立しつつある。この方法では従来に比べて短時間で膜張力の変化を捉えることができるのでリアルタイムで張力変化を捉えることを目指す。
一方、このような人工膜の系を使って、チャネル蛋白質をその場で合成・膜挿入を可能にする実験を世界ではじめて成功した（in vitro発現ー機能測定法；Iwamoto et al. ACS Synth. Biol. 2018）。チャネルのDNAを加えることで10数分後にはチャネル活性を測定することができた。これは従来の大腸菌での合成に比べて格段に実験効率が上がっただけでなく、そもそも膜蛋白質が翻訳後、どのようにして膜に組み込まれ、活性チャネルが形成されるか、という基本的問題を解くための実験系が確立したことになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
私達の開発した接触液滴法（CBB）によってチャネル電流記録が格段に容易になっただけではなく、新しい灌流法を開発し発表した（Iwamoto & Oiki, Sci. Rep. 2017）。この方法により脂質二重膜のリン脂質組成を自由に変化させることができるようになり、現在さまざまな実験を進めている。この過程で膜張力によるイオンチャネルの新しい制御機構を発見し、その機構を解明することができた。この実験のために膜張力の絶対値を測定する方法を確立することもできた。これは現在有力雑誌に投稿中である。一方、試験管中ではなくCBB中でin vitroチャネル機能発現系を行い、チャネル発現に成功した。チャネルの発現開始から機能開始に至るまでの時間を初めてたどることができた。この方法は本研究の基盤技術として今後も十分に活用されることになる。
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| Strategy for Future Research Activity |
チャネル機能測定中に膜張力の変化を短時間（10秒以内）に測定する方法を開発中である。従来の方法だと複数の電位コマンドをかけ、CBBの形状を何度か測定しなければならなかった。この新しい方法が完成すると、膜張力とチャネル活性の関係をほぼリアルタイムで、より詳細に解明することができる。現在基礎データを蓄積中であり、これと従来法を比較することにより新しい方法の有効性が検証される。この方法は従来研究されてきた機械受容チャネル研究にも応用することのできる技術となり、広く利用されるよう発表する。
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