2018 Fiscal Year Annual Research Report
脂質二重膜での心筋小胞体Ca2+輸送調節装置の超微細構造解析と創薬への応用
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17H04033
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
乾 誠 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70223237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
本田 健 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (30457311)
酒井 大樹 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40464367)
倉増 敦朗 山口大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (90302091)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 心不全治療薬 / ホスホランバン / カルシウム輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心筋小胞体の膜蛋白質ホスホランバン(PLN)は、Ca2+ポンプATPase (SERCA)による心筋小胞体Ca2+輸送を抑制的に調節し、Ca2+制御で中心的役割を果たしている。このSERCA-PLN系は、新たな心不全治療薬の標的としても注目を集めている。 本研究では、SERCA-PLN系に作用する薬物をデザインすることを目指し、SERCA-PLN系を低温電子顕微鏡（cryoEM）で解析する。
昨年度、SERCAと単量体を形成するPLN変異体を繋いだ融合タンパク質を機能を保持した形で大量精製し、ナノディスクへの再構成した。このナノディスクをcryoEMで構造解析したが、薬物デザイン可能な十分な解像度は得られなかった。この融合タンパク質の分子量が約100,000とcryoEMでの解析限界に近かったためと考えられる。
そこで、SERCA-PLN系として、SERCAと５量体を形成する野生型PLNを２０個のグリシンで繋いだ融合タンパク質で解析することとした。この融合タンパク質も野生型PLNと同様に５量体を形成し、分子量が約500,000となる。５量体を形成する野生型PLNの可溶化は非常に困難で、これまでSDSやカオトロープなどの変性剤が使われてきた。しかしながら、このような条件下では、可溶化は出来ても、ATPase活性すなわち機能は完全に失われてしまう。そこで、この５量体の融合タンパク質を発現するバキュロウイルスを作成し、昆虫細胞のミクロゾームからさまざまな条件での精製を試みた。その結果、界面活性剤のdodecyl maltosideとTween-20を組み合わせることによって機能を保持しで精製することに成功した。更に、ナノディスクへ界面活性剤除去ビーズを用いて再構成する方法も確立した。この再構成ナノディスクを用いて、現在、cryoEMで解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SERCA-PLN系の超微細構造を明らかにするため、SERCAと単量体を形成するPLN変異体を２０個のグリシンで繋いだ融合タンパク質を脂質二重層のナノディスクに再構成し、超微細構造解析を行った。しかし、この単量体のSERCA-PLN融合タンパク質は、cryoEMで十分な解像度が得られなかったため、SERCAと５量体を形成する野生型PLNを２０個のグリシンで繋いだ融合タンパク質で解析することとし、精製法並びにナノディスクへの再構成法を確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
単量体のSERCA-PLN融合タンパク質は、分子量約100,000とCryoEMによる構造解析ができる限界に近く、高解像度のデータが得られなかった。これに対し、５量体を形成するSERCA-PLN融合タンパク質は、分子量約500,000とCryoEMで高解像度のデータが得られる確立は極めて高い。高解像度のデータが得られれば、精度の高い薬物デザインが可能となると考えている。
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