Gα13-RhoGEF細胞情報伝達系の構造と分子間相互作用機構の解明

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04034
• Research Institution: Yokohama College of Pharmacy
• Principal Investigator: 小笹 徹 横浜薬科大学, 薬学部, 教授 (70202059)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柊元 睦子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (30321756)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 三量体Gタンパク質 / G12/13 / RhoGEF / RhoA / シグナル伝達 / クライオ電子顕微鏡 / タンパク質相互作用

Outline of Annual Research Achievements

1.G12/13-RhoGEF-RhoAシグナル伝達系の解析
H30年度は、引き続きGalpha13 及びRHドメイン及びDH/PHドメインを含むLARG(leukemia associated RhoGEF)のリコンビナントを大量に調製し、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより複合体を調製し結晶化条件の検討を続けたが、タンパク質の結晶を得られなかった。そのため、クライオ電子顕微鏡を用いた複合体の構造解析を開始した。Galpha13とLARGの複合体をクロスリンクして安定化させたのちに、電子顕微鏡による負染色により画像解析をおこない、３D再構成像を得ることができた。この結果を元に、現在はクライオ電子顕微鏡による複合体の解析条件の検討を進めている。

2. G13-RhoGEFの分子間相互作用解析によるホットスポットの同定。
Galpha13において、Galpha13とp115RhoGEFのRHドメイン複合体のX線結晶構造解析より解明したRhoGEF活性化及びGAP活性化に重要と考えられる点突然変異体のリコンビナントタンパク質を調製した。今後は、これらのリコンビナントタンパ質を用いて、Galpha13とRhoGEFの分子間相互作用の解析をSPRにより行う計画である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成３０年度は、研究代表者の横浜薬科大学での新しい研究室の整備も進み、実験体制を整えることができた。研究分担者が理化学研究所で行っているGalpha13とRH/DHドメインを含むRhoGEFの複合体解析は、クロスリンカーを用いて複合体をより安定化することにより、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析が進展しつつある。現在、負染色での３次元再構成に成功していて、今後はクライオ電子顕微鏡での観察条件の検討を進める計画である。また、Galpha12とp115RhoGEFのRHドメインの複合体の構造解析も進めていて、その結果を論文にする計画である。Galpha13-RhoGEF相互作用の動的解析については、相互作用におけるホットスポット候補部位の変異体のリコンビナントタンパク質を精製して、これらを用いて相互作用解析を行う予定である。また、同時に転移性の大腸がん細胞株を用いて、LPAやPGE2による細胞遊走能促進反応におけるG12/13-RhoGEF伝達系の関与の解析も進めて行く計画である。

Strategy for Future Research Activity

Galpha13とRhoGEF複合体の構造解析を引き続き行う。クロスリンカーを用いて複合体を安定化させ、研究分担者の所属する理化学研究所に新たに設置されたクライオ電子顕微鏡によりその３次元構造を解析する。また、RhoAを含むGalpha13-RhoGEF-RhoAの３者複合体についても構造解析を試みる。Galpha13-RhoGEFの分子間相互作用の動的な解析については、変異体タンパク質の精製をさらに進めて、BiacoreT200を用いてSPR解析を行う。さらに、転移性大腸がん細胞株を用いて、G12/13-RhoGEFシグナル伝達系の細胞遊走や浸潤での役割の解析を行う計画である。