2017 Fiscal Year Annual Research Report
Tracing of transmission routes of tuberculosis using geographical information of patients and genetic analysis of clinical isolates
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17H04136
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
和田 崇之 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (70332450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 直哉 東京大学, 生産技術研究所, 特任講師 (00637449)
中谷 友樹 立命館大学, 文学部, 教授 (20298722)
山本 香織 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 研究員 (70649011)
竹内 昌平 長崎県立大学, 看護栄養学部, 講師 (80432988)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 分子疫学 / 感染症 / 結核 / ゲノミクス / 地理情報解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、まず本課題において集計する結核患者の疫学情報、特に居住地を主要なデータとした地理情報の利用に関する研究倫理について研究代表者所属機関の倫理委員会より承認を得た後、匿名化を行った。これらの患者群から分離された結核菌は培養後にゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンサーMiSeqにて各株の短鎖ペアエンド配列 (300 bp x2) を得た。さらに、これらの配列を既知の結核菌ゲノム配列にマッピングして変異探索を行い、変異箇所に基づく比較から菌株の異同を判定した。
日本国内での分子疫学調査に利用されている遺伝型別 (VNTR型別) 法では、それぞれの菌株で24領域の多変領域の遺伝多型を決定し、その比較から菌株の異同判定を行う。同手法によって判定された一致・不一致は概ねゲノム解析に基づく系統解析と矛盾しない傾向を示したが、直近の伝播・発症の場合における菌株間のゲノム相違は極めて微小であることを考えると、VNTR一致株であっても大きな変異差を含んでいることが多かった。すなわち、VNTR型別判定は、菌培養陽性患者間の伝播経路推定において、必ずしも直近の伝播を反映した結果を与えているわけではないことを裏付けた。
本課題では、患者居住地の地理情報を患者間の病原体伝播可能性の指標として用いるため、各患者の居住地座標から計算される患者間距離定義を複数考案した。また、各患者の疫学情報（年齢、性別、居住地、出生国、発症から診断までの日数、薬剤感受性など）を保健所が保管するデータベースから抽出し、次年度以降の解析準備を整えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
日本国内でもっとも結核罹患率が高い大阪市の新規登録結核患者（40歳未満）をモデルとして、2012-15年に分離された結核菌株（181株）の全配列解読を終了した (MiSeq, Illumina)。また、これらの登録患者における疫学情報、居住地に加え、それ以外の地理情報（勤務地など）も付加的に取りまとめている。菌株の簡易遺伝型別 (VNTR型別) も取得済みであり、解析に必要なデータだけでなく、今後の応用的展開を踏まえて幅広く疫学情報を取り揃えたことになる。
患者居住地の地理情報を利用するための患者間距離としては、 (1) 座標間距離、(2) 広域地域区分（都心部、西部臨海部、南部、東部、北東部）に基づく区間距離、(3) 大阪市24区に基づく区間距離を規定した。また、(4) パーソントリップ調査に基づくメッシュ間の人流頻度データから地域を区分化した場合（生活交流圏）の区間距離、(5) 患者居住地ごとの人流頻度を患者間距離に換算する人流頻度距離を定義した。(1) では、座標間の直線距離および道路ネットワーク距離を選択した。(4)では、ネットワークのコミュニティクラスタリング分割手法であるMap Equationにより生活交流圏を導出した。(5)は患者同士の距離行列を与えることになり、患者情報をペアワイズ（２患者の組み合わせ）として処理することになる。このために必要な変換スクリプトについても既に構築済みであり、1年目にあたる本年度の研究計画の進捗は達成されたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、予定通りの研究推進方策として、患者居住地データおよび距離定義に従い、各患者間距離を算出する。これらと前年度までに蓄積した結核菌株遺伝型別情報、患者疫学情報を合わせ、菌株ゲノム情報に基づく異同判定にどの程度近づけることができるかを調べる。患者間距離の定義はそれぞれの値に基づいて解析した場合に、どの定義が最も妥当かを比較して検討する。現在、同等の患者データを保有する海外カウンターパートとの共同研究を模索しており、現地での菌株遺伝子解析や人流データの確保を並行的に進めることで、研究展開の拡充を図る予定である。
保健所から抽出できた患者データには、居住地以外にも勤務地や学校、病院など、複数の地理情報が含まれていることがある。こうした情報を患者間距離定義に組み込む場合、居住地しか情報がないケースと整合性を取る必要があり、その具体的な方法についても画策する。
比較ゲノムデータは、菌株間の詳細な分子系統解析に用いることができる。この際、解析結果は分子系統樹によって描画される。本課題では、これまで蓄積してきたデータを応用し、結核菌近縁株の分子系統樹を地図上に画出する可視化手法を考案する。本手法は、VNTR型別によって区別できない近縁株を例として実用化を試みる。具体的には、国内各地で一様に頻出することが知られているVNTR型別株を対象とした比較ゲノム解析を実施し、それらの系統相似性を地図上にプロットする。ここから、系統解析に基づいて推定される時系列推移と地理情報から可視化される空間的拡散を一元的に出力できる事例として提示する。
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