2017 Fiscal Year Annual Research Report
房水動態と創傷治癒におけるエピゲノムとファイブロサイトに着目した緑内障病態の研究
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17H04351
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
谷原 秀信 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (60217148)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 俊洋 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (00317025)
藤本 智和 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (50756426)
高橋 枝里 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60622602)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 眼科学 / 緑内障 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
緑内障病態におけるエピゲノムと循環ファイブロサイトの関与を解析することによる緑内障病態理解のパラダイムシフトと、新規ターゲット同定による創薬を目指し研究を進めている。本年度はin vitroでの検討、特にエピジェネティック薬であるHDAC阻害剤やDNMT阻害剤の房水流出路および緑内障術後創傷治癒に関する影響について検討を進めた。
サル線維柱帯細胞にTGF-β2刺激を行うと、fibronectin、collagen1等の細胞外マトリクスの産生が亢進し、F-actinの増加、α-SMA陽性細胞の増加が認められた。HDAC阻害剤であるSAHAは、TGF-β2によるfibronectinやcollagen1等の細胞外マトリクス産生亢進を抑制し、phalloidineによるF-actinの染色性も低下させた。
術後創傷治癒に対するエピジェネティクス薬の影響についてヒト結膜線維芽細胞を使用し検討を行った。TGF-β2刺激による筋線維芽細胞への形質転換をSAHAが有意に抑制すること、その作用が一部のTGF-β2シグナルの抑制を介していることを明らかにし報告した。DNMT阻害剤を前処置した結膜線維芽細胞ではTGF-β2により誘導されるα-SMA、collagen1、Smad3の発現が抑制された。しかし、fibronectinは有意に抑制せず、DNMT阻害剤はTGF-β2による結膜線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を部分的に抑制することが示された。
結膜繊維芽細胞の形質転換によるサイトカインレベルの変化と細胞遊走に与える影響について検討を行った。筋線維芽細胞への形質転換によりMCP-1濃度は低下し、IL-6およびPDGF-AAの濃度は増加した。単球系細胞株THP-1細胞を使用し細胞遊走作用について検討を行った結果、筋線維芽細胞の上清による遊走細胞数は線維芽細胞の上清に比べ有意に低下した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エピジェネティクス薬のin vitroでの評価について予定通り検討を進めることができ、線維柱帯細胞および結膜線維芽細胞に対するデータを取得し、興味深い知見が得られている。さらに結膜線維芽細胞の細胞遊走への影響についても検討が進み論文報告を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
緑内障症例に対して眼科手術を行う際に房水・結膜/テノン嚢サンプルの採取し、サイトカイン、エピゲノムおよびmiRNAの変化について解析を行う。また、ヒトサンプルの解析と並行して動物由来の房水、結膜・テノン嚢サンプルを用いたサイトカイン、エピゲノムおよびmiRNAの変化について解析を行う。ヒトおよび動物組織より結膜・テノン嚢線維芽細胞の単離を試みる。単離した細胞のエピゲノム変化を調べるため、ヒストンのアセチル化およびDNAのメチル化を、それぞれウエスタンブロッティングおよび次世代シークエンサーを用いて解析する。
ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害薬およびDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）阻害薬を用いて、エピゲノム変化が房水流出路に与える影響について検討する。本年度は細胞外マトリックスタンパクであるフィブロネクチンやコラーゲンタイプⅠに対する影響を検討し、これらの阻害剤がTGF-β2刺激による細胞外マトリクスの産生を抑制する効果が認められた。今後はシュレム管内皮細胞膜透過性のin vitro定量評価系や前眼部灌流システムを用いて、房水流出路への影響を考察する。また、TGF-β2刺激後の細胞内シグナルとHDAC阻害剤、DNMT阻害剤の関係についても検討を進める。
マウスの炎症惹起モデルに対して、2光子顕微鏡を用いた4次元イメージングを行う。HDAC阻害剤は結膜線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換を抑制すること、さらにDNMT阻害剤もTGF-β2刺激による結膜線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換を一部抑制する効果が確認された。これらの薬剤の炎症細胞動態への影響について2光子顕微鏡を用いた4次元イメージングにより観察する。
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