運動器疾患治療のための中枢・末梢機能の活性化を担う分子基盤の解明と治療法の開発

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H04409
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 佐藤 毅 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (60406494)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 臼井 通彦 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10453630) ; 古株 彰一郎 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (30448899) ; 有吉 渉 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (40405551)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Auts2 / 骨芽細胞 / Tas1R3

Outline of Annual Research Achievements

本年度は骨芽細胞におけるAuts2遺伝子のin vitroにおける機能解析、そしてin vivoにおける機能解析のための準備を行なった。
in vitro実験の計画として、まず骨芽細胞にAuts2遺伝子が発現しているかどうかをリアルタイムPCR法にて検討したところ、骨芽細胞におけるAuts2遺伝子発現を確認できた。Auts2遺伝子を骨芽細胞においてノックアウトした細胞をユニーテック社に作製依頼した。その結果、ヘテロ並びにノックアウト細胞を作出することができた。それと並行して、骨芽細胞にプラスミドを導入して過剰発現系の実験を行うこととした。そのために、vector builder社にAuts2遺伝子のレトロウイルス用ベクターを作製依頼した。これとは別に、Auts2の様々なdeletion mutantの発現ベクターを所有しているグループからプラスミドを供与していただくことができたため、プラスミドを増やしている。また、Auts2タンパク質の良好な抗体を作製するために、ユーロフィン社に作製を依頼した。
次にin vivoでの実験としてAuts2ノックアウトマウスは胎生致死のため、骨芽細胞特異的コンディショナルノックアウトマウスの作製を計画した。Auts2遺伝子のfloxマウスが必要であるため、すでにfloxマウスを所有しているグループからの入手を試みた。Gao ZらへAuts2遺伝子のfloxマウスのリクエストを行なったところ返答がなかった。研究が遅れることを懸念し、Auts2遺伝子のfloxマウスを作製することにした。ユニーテック社に作成依頼を行い、現在作成中である。
一方で、われわれはTas1R3遺伝子が骨芽細胞に発現していることを確認していることから、Tas1R3 floxマウスの作製をセツロテック社に依頼している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Auts2に関するin vitro解析のツールの準備が整いつつあり、floxマウスの作製に着手できている、また、Tas1R3 floxマウスの作製にも着手できているため。

Strategy for Future Research Activity

Auts2遺伝子をノックアウトした骨芽細胞に対して、BMPを作用させて分化誘導されるかどうかを検討する。また、Auts2を骨芽細胞に強制発現させてBMPを作用させて分化誘導されるかどうかを検討する。さらに、次年度中にAuts2 floxマウスが入手できるため、共同研究者からRunx2 Creマウスやosterix Creマウスを入手して掛け合わせる。Tas1R3 floxマウスについては、研究分担者のラボに搬入して解析を進める予定である。