2017 Fiscal Year Annual Research Report
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17H04418
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
木戸 淳一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 准教授 (10195315)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
篠原 康雄 徳島大学, 先端酵素学研究所(プロテオ), 教授 (60226157)
廣島 佑香 徳島大学, 先端酵素学研究所(プロテオ), 特任助教 (60545143)
吉田 賀弥 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 講師 (60363157)
成石 浩司 徳島大学, 病院, 講師 (00346446)
稲垣 裕司 徳島大学, 病院, 講師 (50380019)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工細胞 / リポソーム / 抗菌ペプチド / 無細胞蛋白質合成 / オーラルケア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H29年度は，人工細胞の細胞膜成分としてのリン脂質種およびリポソームの形成法の検討を行った。その結果，Phosphocholine 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3(DOPC)と3-sn-Phosphatidylcholine (Egg Yolk)の2種のリン脂質，およびグルコースとシュークロースとの水溶相との間で反応させる自発的転移法によりリポソーム胞体を調製した。各成分の至適濃度の検討により，直径14-170 umの球形のリポソームの作製が可能となったが，自発的転移法ではリポソームサイズのコントロールが困難であり，現在，一定サイズのフィルターによるリポソーム作製用装置を用いたリポソームの作製の検討を行っている。
一方，無細胞蛋白質合成系による抗菌ペプチド蛋白の合成については，beta-Defensin 2，S100A8およびS100A9蛋白合成に必要な各鋳型DNAを作製した。無細胞蛋白質合成キット(1-Step Human Coupled IVT-Kit DNA)を用いて，b-Defensin, S100A8とS100A9の合成反応を行った結果，ウエスタンブロット分析によりS100A8の合成は確認できたが，beta－Defensin 2とS100A9の合成は確認できなかった。また，その他の抗菌ペプチドであるLipocalin 2とSecretory leukocyte protease inhibitor (SLPI)については，別の無細胞蛋白質合成キット(PUREfrex 2.1）用の鋳型を作製し，蛋白合成反応の準備を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
H29年度にリポソーム人工細胞の調製と無細胞蛋白質合成系の確立に取り組んだ。
リポソーム成分となるリン脂質を選択し，自発的転移法によりリポソームの作製には成功したが，リポソーム体のサイズのコントロールが困難であり，リポソーム調製法の確立がやや遅れている。
無細胞蛋白質合成キットを用いた抗菌ペプチド合成については，5種類の抗菌ペプチドの鋳型DNAを調製した。使用する合成キットにより，鋳型DNAが異なることや，同じ合成キットを用いても，合成されるペプチドとされないペプチドがあり，その条件検討のために遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
リポソームのサイズをコントロールする改善策として，リポソーム作製用装置（Mini-Extruder: Avanti）を用いて一定サイズのリポソームの作製を行う。すなわち，メンブラン孔径が1 micro mのポリカーボネートメンブランをリポソーム作製装置に装着し，DOPC-GlucoseとEgg-PC－Sucroseのリン脂質系を用いることにより，ジャイアントリポソームサイズのリポソーム作製系を確立する。また，リポソームの内層と外層を識別するために，DOPCに緑－蛍光色素のNBD-PEを，また，Egg-PCに赤－蛍光色素のRhodamine-PEを添加し，リポソームを作製後，蛍光顕微鏡観察を行うことにより，内外層の識別を行う。
抗菌ペプチドの無細胞蛋白合成については，複数の合成キットを用いてbeta-Defensin, Lipocalin 2およびSLPIの各キットに対応した鋳型DNAを調製した後，抗菌ペプチドの合成反応の至適条件を検討する。具体的には，PUREfrex2.1キットなどでS-S結合を含む蛋白合成用追加試薬の使用や分子シャペロンの添加などを行い，蛋白合成高率の改善を目指す。
H30年度については，確立した蛋白合成系のリポソーム内への封入とPCR法を応用したリポソーム人工細胞の増殖系の確立の基礎実験を行う。
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