2017 Fiscal Year Annual Research Report

Formation of abnormal neural circuit elicited by microglia with modulated gene expression exposed to environmental chemicals

Research Project

Project/Area Number	17H04714
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	石原康宏広島大学, 総合科学研究科, 助教 (80435073)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ミクログリア / 発達神経毒性 / 神経回路網形成 / バルプロ酸
Outline of Annual Research Achievements	化学物質の中には、胎児期に曝露すると成長後の行動異常を引き起こすものがあることが分かっている。着目すべきは、これら化学物質の多くがエピゲノムに影響し得ることである。また、脳内の免疫細胞であるミクログリアがスパインやシナプスの貪食を介して発達期の神経回路網の形成に関わることが明らかになりつつあり、ミクログリアと行動異常との関連が議論されている。これらの背景から、本研究では、『化学物質はミクログリアの遺伝子発現を長期的に変化させ、その結果ミクログリアが活性化し、異常な神経回路網が形成される』との仮説を検証する。本年度は試験物質として、まず、胎児期の曝露によりヒトおよび実験動物（マウス、ラット）で成長後の行動異常が確認されているバルプロ酸を使用する。妊娠マウスをバルプロ酸に曝露させたところ、成長後の仔の空間認知機能と社会相互作用が低下し、反復行動を示した。バルプロ酸の胎児期曝露は、発達期のミクログリアを過剰に活性化し、シナプス数を減少させた。このシナプス数の減少は一過的であり、成長後のシナプス数は、コントロール群とバルプロ酸曝露群でほぼ同数であった。以上の結果より、胎児期のバルプロ酸曝露は発達期のミクログリアを活性化することが明らかとなり、また、発達期に活性化したミクログリアは、発達期におけるシナプスの減少や成長後の行動異常に関与する可能性がある。来年度以降、ミクログリア活性とシナプス減少、行動異常との相関を明らかにし、ミクログリア活性化メカニズムを追及する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度はバルプロ酸の発達神経毒性を、ミクログリアに焦点をあてて検討した。ICR マウスに対しバルプロ酸を800mg/kg の用量で胎生11 日に経口投与した。出生後（6週齢）の行動異常を、オープンフィールド試験、新規物体認識試験、社会相互作用試験、Y字迷路試験、ガラス玉覆い隠し試験から成る行動テストバッテリーにより評価したところ、移動活動量に差は認められなかった一方、バルプロ酸の胎児期曝露により空間認知機能と社会相互作用が低下し、反復行動を示した。10日齢マウスのミクログリア活性を調べたところ、バルプロ酸曝露によりミクログリアはアメーバ様の形態に変化し、貪職マーカーであるCD68の発現が増加していた。また、このとき、PSD95染色点が減少していたことから、シナプスが減っていると考えられる。以上の結果は、バルプロ酸胎児期曝露により、発達期ミクログリアの異常な活性化とシナプス数の減少、成長後の行動異常が生じることを示している。現在、シナプス数の減少や行動異常がミクログリアの活性化に起因するかを調べるために、ミクログリア活性化抑制薬であるミノサイクリンを経母乳投与したマウスを作製中である。これらマウスのPSD95染色と行動テストバッテリー測定より、発達期に活性化するミクログリアの役割が明らかになると考えている。以上、着実に研究が進んでいることから、『おおむね順調に進展している』とした。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度に遂行する予定の測定項目は以下の3点である。バルプロ酸により発達期に活性化されるミクログリアについて、活性化メカニズムとその役割の解明を目指す。 ① ミクログリア活性化抑制薬ミノサイクリンのシナプス数、行動異常に対する効果：ミクログリア活性化抑制薬であるミノサイクリンを経母乳投与したマウスを作製する。これらマウスのPSD95染色と行動テストバッテリー測定より、発達期に活性化するミクログリアがシナプス数の減少や行動異常を引き起こすかを評価する。 ② バルプロ酸による異常神経回路網形成の評価：バルプロ酸胎児期曝露によりシナプス数が減少し、また行動異常が生じることから、バルプロ酸曝露は異常な神経回路網の形成を誘導することが示唆される。そこで、コントロールマウス、バルプロ酸胎児期曝露マウスから得た急性スライスを光計測（膜電位感受性色素を用いた神経機能のイメージング）に供し、形成される異常な神経回路網を検出する。また、回路の興奮-抑制バランスについても評価する。 ③ バルプロ酸胎児期曝露により発現変動する遺伝子の同定：バルプロ酸を胎児期に曝露した時、ミクログリア活性化が検出されるのは生後10日目である。一方、バルプロ酸は2-3日で体内からほぼ完全に消失するため、ここで見られるミクログリア活性化はバルプロ酸の直接作用であるとは考え難い。そこで、エピジェネティクスに着目する。バルプロ酸に曝露したマウス海馬からミクログリアを密度勾配遠心法により単離し、CAGE-seqにより発現が変化する遺伝子、および活性が変化する転写因子の同定を目指す。