2018 Fiscal Year Annual Research Report
内耳増幅の超分子メカニズム解明を目指した膜タンパク質操作・計測技術と新機能の創生
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17H04739
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
村越 道生 鹿児島大学, 理工学域工学系, 准教授 (70570901)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プレスチン / 外有毛細胞 / 内耳 / 聴覚 / タンパク質モーター / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では，内耳の感覚細胞に発現する“プレスチン（prestin）”に着目し，その構造と機能を自在に制御する技術とこれを捉える計測技術の開発に取り組むことで，音受容メカニズムの解明及びそのユニークな機能を応用した新機能（ナノバイオデバイス）の創生を目指す．この目標達成に向け，（１）「膜タンパク質発現・精製（採る）」，（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」，（３）「分子構造可視化（見る）」，（４）「デバイス化（創る）」の4つの達成目標を設定した．
本年度はまず（１）「膜タンパク質発現・精製（採る）」について，昨年度からの継続課題である目的タンパク質の発現確認に取り組んだ．チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に高効率精製用ベクターに組み込んだprestin遺伝子をリポフェクション法により導入し，薬剤選択の後，mRNAによる発現確認によって，高発現が期待できる株の獲得を目指した．その結果，EF1αプロモーターを有するベクターを用いた細胞株を12クローン，CMVプロモーターを有するベクターを用いた細胞株を5クローン作製することに成功した．これらクローンのうち，EF1αプロモーターを有する4種類のクローンに対してSDS-PAGE/ウェスタンブロッティングによってタンパク質レベルで発現確認を実施し，そのうち一つの株が他の株よりも高発現であることが確認された．次に（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」について，平面パッチクランプ装置を導入し，上記（１）で作製したprestin発現細胞株に対してこれを適用することで性能評価を実施した．その結果，prestin発現細胞においてのみ，細胞内圧力（膜張力）に依存した膜電流の存在が確認された．これはprestinのピエゾ特性を示す結果であり，当初の我々の予想を支持する結果となった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度にプレスチンの大量発現系構築を目指した動物細胞用発現ベクターの構築を実施したが，これに計画よりも時間を要したこと，さらにその下流過程にあったSDS-PAGE/ウェスタンブロッティングによるタンパク質の発現量確認についても，計画通りに実験が進まず時間を要したことから計画全体に遅れが生じている．
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| Strategy for Future Research Activity |
計画全体に遅れが生じているものの，CHO細胞への遺伝子導入及び薬剤選択による高発現株の構築は終えており，構築した17クローンのうち4クローンについては目的タンパク質の発現確認が完了している．来年度早期に発現確認を終えると同時に，当初計画で計画していた高効率精製系の確立および高密度prestin脂質膜の構築に取り組みたい．具体的には，精製・抽出においては高効率化のため，ビーズ式細胞破砕機及び超遠心機を導入し細胞膜各分の回収効率の向上を図り，またHisタグによる精製方法の至適条件について検討を進める．また，（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」についても検討をはじめたい．Prestin構造変化の可視化を念頭に，昨年度導入した平面パッチクランプシステムを用いて，まずは市販のグラミシジン（モデルイオンチャネル）を用いた性能試験により，装置の機能評価を実施する．
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