2020 Fiscal Year Annual Research Report
内耳増幅の超分子メカニズム解明を目指した膜タンパク質操作・計測技術と新機能の創生
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17H04739
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
村越 道生 金沢大学, フロンティア工学系, 准教授 (70570901)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プレスチン / 外有毛細胞 / 内耳 / 聴覚 / タンパク質モーター / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では，内耳の感覚細胞に発現する“プレスチン（prestin）”に着目し，その構造と機能を自在に制御する技術とこれを捉える計測技術の開発に取り組むことで，音受容メカニズムの解明及びそのユニークな機能を応用した新機能（ナノバイオデバイス）の創生を目指す．この目標達成に向け，（１）「膜タンパク質発現・精製（採る）」，（２）「電気-機械変換誘導（動かす）」，（３）「分子構造可視化（見る）」，（４）「デバイス化（創る）」の4つの達成目標を設定した．
本年度は，（１）について，より高発現な細胞株の選択に向け，EF1αプロモーター系細胞株およびCMVプロモーター系細胞株をそれぞれ30クローンずつ作製した．試行的に一部のクローンについて，ウェスタンブロッティングによって発現確認を行ったところ，CMV系よりもEF1α系のほうがより高発現である可能性が示唆された．これは昨年度までに得た知見と同様の傾向であった．また，現在mRNAの発現確認によるスクリーニングの準備を進めているところであり，これにより120のクローンから効率的に高発現株の選択を試みる計画である．（２）および（３）について，飽和脂質であるジパルミトイル・フォスファチジルコリン（DPPC）および不飽和脂質であるジオレオイル・フォスファチジルコリン（DOPC）を用いた混合脂質（二成分系）二重膜を作製し，脂質ドメイン構造の構築を試みた．原子間力顕微鏡（AFM）により観察したところ，両脂質がドメイン構造を形成しながら安定化していることが明らかとなった．現在，膜画分のみを分離抽出するため，パーコールを用いた超遠心の条件検討を行っており，これにより後段のHisタグを用いたプレスチンの生成効率の向上を試みている．作製した脂質二重膜に精製したプレスチン分子を再構成することで，外有毛細胞の細胞膜構造を模したラフトモデルを作製する計画である．
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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