2018 Fiscal Year Annual Research Report
複雑な分子間反応の連鎖を光操作で解き明かすーアポトーシス機構の分子論的理解ー
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17H05001
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中曽根 祐介 京都大学, 理学研究科, 助教 (00613019)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アポトーシス / 過渡回折格子法 / 光解離反応 / Caspase / 分子間反応 / 光操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アポトーシス機構の分子論的理解を目的とし、関連因子の活性を効率的に光制御する系の構築を試みた。まずはアポトーシス実行因子であるCaspase-3, Caspase-7を対象に、青色センサーLOVドメインの構造変化を利用した分子設計を多数試みたが、暗状態・明状態を問わず高い活性を持つことがわかった。実際にデザイン蛋白質を発現させた細胞は光照射の有無にかかわらず高い確率で細胞死が誘導されることがわかった。
そこで新しい光操作素子として光でペプチド鎖が開裂し、二分子に解離する人工蛋白質（photocleavable protein(PhoCl))に着目した。Caspase-3, -7は分子内の特定部位が上流因子に切断されて活性化するため、PhoClを適切な位置に挿入することで、活性の精密な光制御が可能と考えた。PhoClの光化学反応は未知であったため、その反応検出を過渡吸収測定・過渡回折格子測定により行った。その結果、ペプチド鎖の開裂は早い時間で起こるが、二分子への解離反応は非常に遅いことがわかった（約１時間）。これはペプチド鎖が開裂しても、アミノ酸間の相互作用により解離が起こりづらいためと考えられる。また開裂反応の量子収率が極めて低いことも明らかとなり、効率的な光制御に不向きである可能性が示された。
実際にPhoClをCaspaseに挿入した実験を行ったが、長時間の光照射下でも目立った活性の上昇は検出されなかった。タンパク質内部への挿入により解離反応の収率がさらに低下したためと考えられる。こうした知見は光操作素子の選択、分子設計を行う上で有用な情報である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は人工蛋白質PhoClの反応機構に関する知見を得たものの、アポトーシスの効率的な光誘導法の確立には至らなかった。しかし、アポトーシス関連因子の活性や細胞死を定量する測定系の構築を進め、タンパク質反応と生理活性の比較を行う環境を整えた。今後の研究の進展に役立つと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
光制御する対象をアポトーシス信号伝達カスケードにおいて上流に位置する開始因子Caspase-8, Caspase-9に切り替える。これらは会合体形成時に自己切断を行うことで活性化するため、光で会合するタンパク質を光操作素子として導入する。分子デザインの最適化後、様々な分光法により光駆動される自己切断過程の時間分解検出を行う。さらに下流分子共存下での測定を行い、分子間反応の連鎖を実時間観測する。
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