2020 Fiscal Year Annual Research Report
複雑な分子間反応の連鎖を光操作で解き明かすーアポトーシス機構の分子論的理解ー
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17H05001
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中曽根 祐介 京都大学, 理学研究科, 助教 (00613019)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞死 / 過渡回折格子法 / 分子間反応 / 反応ダイナミクス / 光操作 / LOVドメイン / Caspase8 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アポトーシス機構の分子論的理解を目的とし、関連因子の活性を光制御する系の構築を行った。アポトーシス開始因子であるCaspase8は会合体を形成すると、自己分解により活性化するため、光依存的に会合するLOVドメインを用いて光操作することを試みた。野生型のLOVドメインを付加した場合は、光依存的なアポトーシスを確認できなかったが、LOVドメインに変異を導入し、暗回復速度を遅くすると、低い効率ながら細胞死を光誘導できた。これは暗回復速度と光感受性の強い相関を示しており、光操作においても暗回復速度が重要な因子であることを確認する結果となった。現在も引き続き誘導効率の最適化を進めている。
続いて単離したLOV-Caspase8の反応解析に取り組んだ。過渡回折格子（TG）測定を行った結果、LOVドメイン単体に比べてLOV-Caspase8の分子拡散信号は強度が低下し、遅い時間にシフトすることがわかった。シフトについてはCaspase8の付加による分子量の増大で説明できる。拡散信号の強度は観測する分子のサイズが大きいほど強くなる傾向があるが、それとは逆の結果となった。光依存的なダイマー化に伴う拡散係数変化を、Caspase8の構造変化が相殺した可能性があるが、結論には至っていない。大きな問題点として、TG測定を行うためにタンパク質濃度を上げると、Caspase8が暗状態でも低確率で会合し、自己切断を起こすことが挙げられる。そのため測定試料には全長試料と分解した試料が混在してしまい、信号の再現性を確保できなかった。
本課題は人工的に光反応性を付与することで、多様なタンパク質の反応をTG法により時間分解検出することを大きな狙いとしている。そこで本年度はフォトクロミックな分子（アゾベンゼン）を付加した生体分子の反応検出にも取り組み、未開拓であったタンパク質-DNA相互作用の速度論的解析を推進した。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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