2019 Fiscal Year Annual Research Report
Direct visualization of molecular recognition forces by high-resolution atomic force microscopy and spectroscopy
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17H06122
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山田 啓文 京都大学, 工学研究科, 教授 (40283626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 圭 京都大学, 工学研究科, 准教授 (40335211)
平田 芳樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10357858)
岩田 太 静岡大学, 電子工学研究所, 教授 (30262794)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | ナノ計測 / 走査プローブ顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、主に下記２項目の研究テーマに注力して研究を推進した。
(1) 高度フォースマップ法による生体分子のナノ力学応答計測
生体分子の機能発現は、その機能を担うタンパク質分子のコンフォメーション変化を伴う場合が多い。こうした生体分子の微視的構造の変化は、そのナノ力学応答の変化に対応することから、機能発現メカニズム解明には、生体分子の力学応答の直接計測が有効な手法となる。また、タンパク質分子の微視的弾性は、これら分子から成る細胞や組織の弾性応答に直接つながることから、細胞／組織疾患との関連の点でも興味深い。一方、ナノ力学物性計測に関しては、AFMによるソフトマター粘弾性計測として、分子レベル力学物性の測定は実現されているものの、溶液下の単一生体分子のナノ力学応答に関する研究は十分には進展していなかった。本研究テーマでは、高度フォースマップ法を用いることで、タンパク質分子内のドメイン間のナノ力学応答の違いを測定し、生体機能との関連を探るとともに、タンパク質内ドメインにおけるさまざまな二次構造の違いと、局所弾性およびエネルギー損失との関連について解析した。また、生体分子周囲の水和殻が生体分子の柔軟性に影響することが示唆されており、分子周囲水和構造と生体分子弾性との関連性という観点でも研究を進めた。
(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化
本研究テーマでは、真核生物のDNAの複製初期過程に関わるDNA-タンパク質複合体の複合過程の研究を進めているが、本年度の研究では、引き続き複製フォーク形成過程の研究を進めるとともに、DNA複製プロセスの進行を緩和あるいは停止する特定の領域（RFB: Replication Fork Barrier）についての研究を進め、RFB活性化を担うタンパク質FOB1（Fork-blocking protein-1）とDNAの複合構造の可視化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、以下の２つのサブテーマの研究に注力して、新たな生体分子機能イメージングを確立するための具体的な研究を推進した。
サブテーマ「(1) 高度フォースマップ法による生体分子のナノ力学応答計測」においては、接触領域で動作する液中FM-AFMに基づく、さまざまなナノ力学応答計測法を用いて、生体分子の局所粘弾性を評価した。接触領域での計測を行うことから、比較的小さなばね定数のカンチレバーを使用したが、安定なFM-AFMの動作を確保するために、等価ばね定数が大きい２次共振周波数を使用した。試料のナノ力学応答は、周波数シフト（Δf）一定の状態での第２高調波（共振周波数の２倍）の振幅応答、およびΔf一定における線形たわみを測定することで行った。これらの計測においては、試料上の局所粘性・ゆらぎを反映する散逸力も同時に計測し、上記２つの信号との関連性も調べた。試料には、２次元結晶を形成するタンパク質分子 Annexin A5（A5）、および100 bp長の合成DNAを用いた。線形たわみ計測によって、A5タンパク質の局所弾性率は周囲の脂質よりも小さいことが示されたが、高調波信号もタンパク質ドメイン上で小さくなることを見いだした。DNAにおける線形たわみ信号は、糖-リン酸鎖上で局所弾性率が大きくなることを示した。これに対して、高調波信号は副溝上で増加し、その対応関係は、DNA周囲の水和構造も関連して、複雑な対応となることが判明した。
また、サブテーマ「(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化」では、全長 123 nmのDNAの特定の位置に RFB領域を設け、ヘリカーゼ緩衝液中で FOB1タンパク質分子を結合させて FM-AFM観察を行った。結合位置に関しての揺らぎはあるものの、DNA上の高さ 3 nmのタンパク質分子の結合を捉えることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質などの生体分子はアミノ酸鎖を多重に折りたたんだ階層的な構造を有するが、そのコンフォメーション変化が生体分子の機能発現と密接に関連することが知られている。生体分子の形態変化は、その力学応答と直接的に関係することから、生体分子機能のメカニズム解明に向けて、ナノ力学応答計測は極めて有効な手法である。これまでの研究により、AFMによるナノ力学応答計測法が確立されており、高分子などの粘弾性計測例が報告されている。AFMは生理環境下における単一分子イメージングを可能とする手法であることから、生体分子の分子レベル力学物性計測の実現に向けても極めて有用となる。今後の研究では、高度フォースマップ法を用いることで、DNAナノ構造体やタンパク質２次元結晶を対象に、異なる内部構造間やドメイン間でのナノ力学応答の違いを測定する。また、帰還制御切り替え型のフォースマップ法またはバイモーダルAFMにより局所弾性および局所弾性エネルギー損失の２次元／３次元マッピングを行い、局所構造や弾性率と生体機能との関連について解析する。さらに、フォースカーブ測定時のカンチレバーの励振の有無を切り替えることで、静的／動的局所弾性の計測も行い議論する。また、生体分子周囲の水和殻がタンパク質構造の柔軟性に影響することが示唆されており、分子周囲水和構造と生体分子弾性との関連性という観点でも研究を進める。
光受容性膜タンパク質分子であるバクテリオロドプシン（bR）は、光照射によってそのコンフォメーションを変化し、膜内外のプロトン輸送の役割を担っている。今後の研究においては、フォースマップ法の応用である時間分解AFM 法を用いて、この光誘起によるタンパク質の動的変化過程を分子レベルで捉え、bR内のどの領域でコンフォメーション変化が生じるかを解析し、機能発現との関連性を明らかにする。
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