2020 Fiscal Year Annual Research Report
Direct visualization of molecular recognition forces by high-resolution atomic force microscopy and spectroscopy
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17H06122
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山田 啓文 京都大学, 工学研究科, 教授 (40283626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 圭 京都大学, 工学研究科, 准教授 (40335211)
平田 芳樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10357858)
岩田 太 静岡大学, 電子工学研究所, 教授 (30262794)
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| Project Period (FY) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| Keywords | 原子間力顕微鏡 / フォースマッピング / 単一分子イメージング / 単一分子分光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、主に下記２項目の研究テーマに沿って研究を進めた。
(1) 高度フォースマップ法による生体分子のナノ力学応答計測
タンパク質などの生体分子においては、そのコンフォメーション変化がその機能発現と強く関連することが知られており、生体機能メカニズムの解明に向けて、分子の形態変化を反映するナノ力学応答計測は極めて有効な手法となる。これまでの研究により、AFMによるナノ力学応答計測法は確立されており、実際、高分子などの粘弾性計測例が報告されている。一方、AFMは単一分子分解能を有することから、生体分子の分子レベル力学物性計測の実現に向けても極めて有用となる。本研究テーマでは、高度フォースマップ法を用いることで、DNAナノ構造体やタンパク質２次元結晶を対象に、異なる内部構造間やドメイン間でのナノ力学応答の違いを測定した。また、帰還制御切り替え型のフォースマップ法およびバイモーダルAFMによって、局所弾性および局所弾性エネルギー損失の２次元／３次元マッピングを行い、局所構造や弾性率と生体機能との関連について解析した。さらに、フォースカーブ測定時のカンチレバーの励振の有無を切り替えることで、静的／動的局所弾性の比較計測も実施した。また、生体分子周囲の水和殻がタンパク質構造の柔軟性に影響することが示唆されており、分子周囲水和構造と生体分子弾性との関連性という観点でも研究を進めた。
(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化
高度好塩菌の紫膜を構成するバクテリオロドプシン（bR）は、光照射によってコンフォメーションの変化を引き起こし、膜内でプロトンポンプの役割を果たす。本研究では、フォースマップ法の応用である時間分解AFM 法を用いて、この光誘起による動的変化の過程を分子レベルで捉え、bR内のコンフォメーション変化を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、以下の２つのサブテーマに沿って、新たな生体分子機能イメージングを確立するための具体的な研究を推進した。
サブテーマ「(1) 高度フォースマップ法による生体分子のナノ力学応答計測」においては、高分解能FM-AFMイメージングとナノ力学物性計測を同時に実現可能にする手法である、新規手法の帰還制御フォースマップ法を用いて生体分子のナノ力学物性計測を進めた。測定試料としてDNAを用い、ナノ力学物性計測を実施した結果、DNAの２重らせん構造を形成する糖-リン酸鎖上、および主溝・副溝上での局所弾性率を直接計測するとともに、これらに明瞭な差異があることを見出した。また、カンチレバーの励振・非励振を切り替えることによって、静的／動的局所弾性率を測定し、それらを比較することで、測定周波数に応じて弾性率が変化することを見いだした。一方、AFM測定における表面位置の厳密な特定は、表面近傍と表面下の情報を分離して求めるために必要不可欠な情報となる。そこで、Hertzの接触理論からフォースカーブにおける表面位置を特定し、電気２重層力曲線と接触力曲線を測定することで、表面電荷密度と局所弾性率を分離して測定することに成功した。
また、サブテーマ「(2) 生体分子間認識・相互作用の可視化」においては、フォースマップ法の応用である時間分解AFM 法を用いて、膜貫通タンパク質であるバクテリオロドプシン（bR）分子が光照射によって誘起されるコンフォメーション変化（フォトサイクル）の検出を試み、bR３量体の光照射に対する微視的構造変化を示唆する測定結果が得られた。また、高共振カンチレバーを使用することにより時間分解能をさらに向上させることで、フォトサイクル内におけるより詳細なコンフォメーション変化の可視化計測に向けての指針が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質分子は階層的な構造をもち、その特有なコンフォメーションは生体分子の機能発現と密接に関連している。生体分子のコンフォメーション変化は、その力学応答に反映されることから、生体分子機能のメカニズム解明に向けて、ナノ力学応答計測は極めて有効な手法となる。高分子材料を対象とするナノスケール粘弾性計測については多数の先行研究があり、AFMによるナノ力学応答計測法は確立されているが、こうした計測法を生体試料の解析に応用し、単一分子イメージング法と組み合わせることで、分子レベルの力学物性計測の実現が可能となる。今後の研究では、これまでに確立した帰還制御切り替え型のフォースマップ法（時分割フォースマップ法）をさらに発展させ、帰還制御オフ時に実行する探針位置 (z) の往復動作を、より高度な運動シーケンス制御にすることで、通常のフォースカーブ計測に加えて、ナノ力学応答計測や特異結合の破断計測など多角的ナノ分光計測を簡便に切り替えて実行できるように改良する。これによって、ナノ弾性および局所弾性エネルギー損失の高度な２次元／３次元マッピングを行い、局所構造や弾性率と生体機能との関連を継続して解析する。また、ナノ力学計測においては、その検出信号としてAFMカンチレバーの静的たわみ量を主に用いているが、新たに動的な接触共振周波数の変化を信号とすることで、より高感度な高分解能測定の実現を目指す。さらに、生体分子周囲の水和殻がタンパク質構造の柔軟性に与える影響についての考察を進めるとともに、水和構造と生体分子弾性との関連性という観点からも継続して研究を進める。
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