長鎖長次世代シークエンサによるイネ育種におけるゲノム動態と進化基本過程の理解

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H06246
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 井澤 毅 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (10263443)
• Project Period (FY): 2017-06-30 – 2020-03-31
• Keywords: イネ / コシヒカリ / 次世代シークエンサー / MinION / 挿入 / 欠失

Outline of Annual Research Achievements

計画通り、MiNION長鎖タイプの次世代シークエンサーで、コシヒカリゲノムDNAを解析し、平均Depthが10倍弱のデータを得たが、既存のリファレンスゲノムに張り付けて、SNPを抽出したところ、とても、信頼性を持てるデータにならず、MiNION単独でのリファレンスとの違いを抽出することは断念せざるを得ない状況である。そこで、別の課題で、手元に存在するコシヒカリゲノムのイルミナの短鎖read情報とリファレンスの日本晴ゲノム情報との比較を行い、日本晴とコシヒカリで、挿入/欠失の存在する場所を、挿入は、280か所、欠失は、870か所特定した。その際、試行錯誤の上、MiNIONのデータをLast-splitというソフトを利用し、挿入/欠失の位置の同定を行い、その上で、イルミナのshort read情報をマッピングして、挿入/欠失の有無を評価した。その上で、コシヒカリに挿入が想定される場所に関しては、MinION　readへのイルミナのshort-readを当てることで、挿入の配列の推定を行い、その配列で、トランスポゾンのデータベース等を検索し、コシヒカリ特異的なトランスポゾン等の挙動に関して、解析を行った。その結果、配列を決定できない挿入が多かったが、決定できたものは、LTR型トランスポゾン等、想定される変異が多数同定できつつある。現在、PCR技術を使い、DNAマーカー化することで、挿入の有無をベンチ上で検証する実験を遂行中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画通り、MiNION長鎖タイプの次世代シークエンサーで、コシヒカリゲノムDNAを解析し、平均Depthが10倍弱のデータを得たが、既存のリファレンスゲノムに張り付けて、SNPを抽出したところ、とても、信頼性を持てるデータにならず、MiNION単独でのリファレンスとの違いを抽出することは断念せざるを得ない状況であるため。マッピングの精度を上げるために、かなりの試行錯誤を行ったが、精度よくマッピングすることはできなかった。当初予期していないことが起こったわけで、目的を適宜変更しながら、最終年度における研究内容の変更を検討する。

Strategy for Future Research Activity

上記の理由より、当初の到達点を変更せざるを得ないが、MinIONの長鎖情報を利用することで、挿入・欠失の位置を、通常の次世代シークエンサーを利用した解析より、正確に同定できているので、コシヒカリにおけるその挿入・欠失をゲノムワイドにマーカー化し、親品種と兄弟品種のゲノムで、マッピングをして、コシヒカリの交配育種の時の選抜のゲノム配列の様子を明らかにする。その際の新奇な有用変異の同定等は、MinIONの低精度のため、あきらめ、イルミナのショートリードの解析結果をマッピングすることで置き換える。