2018 Fiscal Year Annual Research Report
インフルエンザウイルスのゲノムパッケージングにおけるＭ２タンパク質の機能解析
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17J00495
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山形 優太朗 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | ウイルス / インフルエンザウイルス / パッケージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛍光を用いたライブセルイメージング等により生細胞内でのインフルエンザウイルスタンパク質の挙動を視覚的に調べるため、蛍光融合タンパク質発現ウイルスの作製を進めたが、感染細胞の観察実験に必要なウイルス力価を充分に得られない、ウイルスの継代の過程で蛍光タンパク質配列が抜けやすく継代安定性に問題がある等、実験で用いるために克服する必要のある課題がいくつか見つかった。また、インフルエンザウイルスのM2細胞質領域とRNPの相互作用をAFMで解析する実験系の構築に先立ち、生化学的手法を用いてM2細胞質領域とRNPの細胞内での相互作用の検出を試みたが、M2とRNPの相互作用を検出することはできず、M2細胞質領域はRNPとの直接相互作用ではなく、宿主因子との相互作用を介してゲノムパッケージングに寄与している可能性が浮上した。
そこで、当初のAFMを用いた解析の計画を変更し、1年目から進めているM2細胞質領域と宿主因子との相互作用の解析に重点を置くことにした。N末端にFlagタグを付加したM2タンパク質及びM2細胞質領域のC末端から22残基を欠損させた変異体タンパク質をプラスミドから細胞内で発現させた後、回収した細胞のサンプルを可溶化処理してFlagタグで免疫沈降し、免疫沈降されたタンパク質をマス解析で同定して比較し、M2細胞質領域C末端22残基と相互作用する可能性が高い宿主因子を選抜した。選抜した各宿主因子をsiRNAでノックダウンした細胞でインフルエンザウイルスを培養し、培養したウイルスの力価を測定することで、ノックダウンによりウイルスの増殖が大きく阻害される宿主因子の探索を行った。その結果、カルサイクリン結合タンパク質CACYBPをノックダウンした細胞において培養ウイルス力価の大幅な低下が確認された。
さらに、今年度は学会でのポスター発表を通して外部への研究成果の発表を積極的に行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2年目の実験計画は、当初はM2細胞質領域とRNPの相互作用を蛍光融合タンパク質発現ウイルスや生化学的手法を用いて解析し、さらに脂質二重膜に組み込まれたM2とRNPとの相互作用をAFMで観察し解析する実験系の構築を予定していた。しかし、研究に応用可能な蛍光融合タンパク質発現ウイルスの作製が難航したり、M2細胞質領域とRNPの相互作用を生化学的手法で確認できなかったり等、当初の想定と異なる研究結果に対応するため、M2細胞質領域が宿主因子との相互作用を介してゲノムパッケージングに寄与する可能性にアプローチする方向で計画変更がなされた。その結果、カルサイクリン結合タンパク質CACYBPがM2細胞質領域と相互作用しパッケージングに寄与する可能性が見出された。当初の期待とは異なる成果になったものの、ゲノムパッケージングにおけるM2の機能解析という観点では、ある程度進展があったと言える。
また、インフルエンザウイルスのゲノムパッケージング機構の解明という観点から、M2細胞質領域と同じくパッケージングへの関与が先行研究で示唆されているPB2分節vRNA内部領域欠損についても研究を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目の実験結果から、M2細胞質領域がRNPとの直接的な相互作用ではなく、宿主因子との相互作用を介してゲノムパッケージングに関与する可能性が浮上した。そこで、当初のAFMを用いた相互作用解析の計画を変更し、2年目の研究で見つかった、M2細胞質領域と相互作用する宿主因子のうち、ウイルス増殖に影響を与える可能性が見出されたカルサイクリン結合タンパク質CACYBPに着目して研究を進める。CRISPR/Cas9を用いてCACYBPノックアウト細胞を作製し、CACYBPノックアウト細胞でのウイルス培養によりウイルスの増殖効率やパッケージングされたウイルス粒子の形状、ウイルス粒子内のRNP量等がどのように変化するかを、電子顕微鏡や生化学的手法等を用いて解析する。この解析結果とこれまでの研究成果を元に、RNPのパッケージングにおけるM2と宿主因子の分子レベルでの相互作用機構の解明を目指す。さらに、1年目から3年目までの研究成果をまとめ、博士論文を執筆する。3年目では、1年目と2年目よりも積極的に研究成果を発表することを目指す。
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