2017 Fiscal Year Annual Research Report
生理活性化合物の新規標的タンパク質同定法の開発と植物シグナル伝達物質受容体の解明
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17J03994
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
穴吹 友亮 北海道大学, 農学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 光親和性標識法 / クリック反応 / 蛍光基 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生理活性化合物の標的タンパク質同定のためには、標的タンパク質を精製し、アミノ酸配列解析に供することが重要である。ビオチンなどの検出基で修飾した生理活性化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる標的タンパク質の精製は多くの研究例がある。しかし、本方法では非特異的に吸着されたタンパク質の混入や回収率の低さという問題があり、標的タンパク質のアミノ酸配列解析を妨げる要因となっている。そこで、本研究では純度が低いサンプルにおいても標的タンパク質の正確なアミノ酸配列解析を可能にするという観点から、蛍光基を利用した新規な標的タンパク質同定法の開発をテーマとした。本手法では、これまでの研究成果を基礎とし、生理活性化合物の化学修飾を最小限に止めたアジドプローブおよびリンカーを用いて蛍光基を標的タンパク質に導入する。今年度は蛍光基を有するリンカーの合成に取り組んだ。研究実施計画では、シクロオクチン、蛍光基、トシル基およびビオチンをリンカーに導入していたが、合成の難しさという観点からリンカーの構造を変更した。新たに設計したリンカーでは、クリック反応に必要なシクロオクチンの代わりにアルキン、標的タンパク質との共有結合形成に必要なトシル基の代わりに光反応基であるジアジリンを導入した。また、ビオチンを導入しないことでリンカーの構造を簡略化した。リンカーは計9ステップで合成する予定であり、現在5ステップの合成を終えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
もし当初の計画通りに研究が進んでいれば、平成29年度内に蛍光基を有するリンカーの合成を終え、モデル実験の結果から本手法が生理活性化合物の標的タンパク質同定に有効であることを示す予定だった。しかし、修士論文の実験結果をまとめて投稿した論文に対して求められた追加実験に時間を割いてしまったため、予定通りの実験を行うことが出来なかった。投稿論文修正のための実験を終えてから蛍光基を有するリンカーの合成を開始したが、リンカーの合成に関しては、これまで大きな問題もなく順調に進んでいる。そのため、進捗は「やや遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き蛍光基を有するリンカーの合成を進める予定である。蛍光基を有するリンカーの合成を終え次第、モデル実験に着手する。モデル実験では、植物ホルモンであるジャスモン酸生合成酵素の1種であるアレンオキシドシンターゼ（AOS）とAOS阻害剤の既知の相互作用を対象とする。AOS阻害剤由来のアジドプローブは過去の研究で合成したものを用いる。組換えタンパク質PpAOS1を過剰発現させた大腸菌由来の粗タンパク質液とアジドプローブおよびリンカーを設計した手法に従い反応させる。本サンプルはトリプシン消化後、蛍光ピークを指標としたnano-LC-MS/MSによるアミノ酸配列解析に供する。本解析で同定したペプチドのアミノ酸配列がPpAOS1由来のものであれば、開発した新手法が標的タンパク質同定に有効であると示される。
また、本手法を用いて12-オキソファイトジエン酸（OPDA）の受容体探索を行う予定である。OPDAは植物ホルモンの一種であるジャスモン酸の生合成中間体であるが、ジャスモン酸とは異なる独自の生理作用を有することが知られている。一方で、OPDAの詳細な作用機序は未だ解明されていない。そこで、本研究ではモデル植物であるシロイヌナズナにおけるOPDAの標的タンパク質同定を行い、作用機序解明に着手する。
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