Pathogenic mechanisms of a new type of functional gastrointestinal disorder by dysfunction of CNP/NPR-B signaling

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17J04685
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 曽川 千鶴 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2020-03-31
• Keywords: NPR-B / Npr2 / CNP / ヒルシュスプルング病類縁疾患 / 消化管 / モデルマウス / 抗体

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、C型ナトリウム利尿ペプチド (CNP)の受容体NPR-Bに変異を持ちCNPシグナルを欠損しているShort-limed dwarfism (Npr2slw) マウスの消化管の形態を詳細に解析するとともに、正常なマウス消化管におけるCNPの標的細胞（NPR-B発現細胞）とNPR-Bの詳細な局在の同定、さらに老化とCNPシグナルの関与について検証した。
Npr2slwは導入後C57BL/6JJmsSlcとの交雑系、C57BL/6JJmsSlcへのコンジェニック系、近交系の3系統の維持を開始し、交雑系由来ホモ個体(Npr2slw/slw)の形態を解析した。免疫組織染色により神経系やペースメーカー細胞（ICC）の存在を詳細に調べた結果、Npr2slw/slwの回盲部や直腸などの狭窄発症部位における神経系やICCは同腹のコントロール個体と同様に存在し、肛門を構成する組織の異常も認められなかった。したがってNpr2slw/slw消化管は神経系やICCが存在するにも関わらず運動不全や狭窄が発生することが明らかとなった。これは、ヒト乳幼児に見られる原因不明の難病でヒルシュスプルング病類縁疾患と類似しており、希少疾患故に治療法の選択肢が少ない難病の治療方開発のための基盤構築へ向けた、非常に重要なモデル動物となることが考えられた。
マウス消化管におけるNPR-B発現細胞とその詳細な局在の同定では、複数の抗NPR-B抗体による統一した染色結果を得ることが出来なかった。そのため抗NPR-B抗体の作成を試みた。抗NPR-Bグアニルシクラーゼドメイン認識抗原を免疫したマウスの抗血清を用いた免疫染色では局在が既報の結果と一致し、筋層間神経叢内部に特異的陽性シグナルが検出されCNPシグナルの消化管神経系への関与が強く示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスの導入については、C57BL/6JJmsSlcとの交雑系、C57BL/6JJmsSlcへのコンジェニック系、近交系の3系統の維持を開始した。消化管に狭窄を発症するホモ個体の詳細な形態解析より、これまで回盲部の狭窄と思われてきた部位では、回盲部の直前、回腸末端部に狭窄が生じていること、結腸が全体的に狭小となっていること、しかし狭窄部位の神経やICCは正常個体同様に存在していることが確かめられた。Npr2slw/slwに見られる狭窄は神経節やICCの欠損には起因していないことを明らかとした。
マウス消化管におけるNPR-B発現細胞とその詳細な局在の同定を試みたが、以前使用した抗NPR-B-C末端側認識抗体は非売品となり入手不可能となった。そのため複数の抗NPR-B抗体を用いて免疫染色を行ったが各抗体で消化管神経系における統一した染色結果を得ることが出来なかった。そこで抗NPR-B抗体の作成を試みた。NPR-Bの抗原認識部位は細胞外ドメイン (ECD: N末端側)、プロテインキナーゼ相同ドメイン (PKH)、グアニリルシクラーゼドメイン (GC: C末端側)の3種類とし、マウスへの免疫後抗血清を得た（NPRB-ECD, NPRB-PKH, NPRB-GC）。抗血清を用いて免疫染色による評価をおこなったところNPRB-GCの局在は既報のNPR-B-C末端側認識抗体の局在と一致し再現性が得られた。
老化とCNP分泌量の関連を調べるため正常マウスの血中CNP濃度を測定した結果、週齢によりマウスで血中CNP濃度がわずかに変化していることを明らかとした。

Strategy for Future Research Activity

CNP突然変異マウスを導入するためNppclbabの固体化が共同研究者側にて進行中である。Npr2slwが受容体に変異を持つのに対し、Nppclbabはリガンドの遺伝子に変異を持つ。言い換えればこの系統はリガンドが欠損し受容体が存在する。このマウスを利用しCNP投与により表現型が変化をするか解析する。
Npr2slwマウスの消化管狭窄部位では神経叢やICCの存在が確かめられたが神経叢内における神経細胞の数や大きさ、グリア細胞のタイプなどが未解明である。それらを解明するため狭窄部位とその上・下について冠状断面の組織票本を作成し免疫染色を行い、定性的・定量的に解析する。数種類に分けられるヒルシュスプルング病類縁疾患のどのタイプにより似ているか検証する。
これまでにNpr2slw/slwマウス消化管の自律運動は正常個体同様に行われてることが確認されているが、記録された波形に正常個体と異なる特徴を持つ。CNPシグナルが欠損したNpr2slwマウス腸管は何、を添加すれば正常個体と同様に動き出すのかex vivoにより添加実験を行う
NPR-Bの詳細な局在を解明するため、作成した3種類のNPR-B抗原をラットに免疫し抗血清を回収する。抗血清を用いた免疫染色で特異的な局在が見られれば、抗原によるアフィニティ精製を行い、既知の細胞マーカーとの共染色を行うことで、NPR-B発現細胞と局在を明らかにしてゆく。
加齢による便秘などの消化管疾患の治療にCNPを応用できるか検証するため高齢マウス消化管のCNPへの反応を検証する。具体的にはex vivoでのCNP添加時の張力変化の測定、in vivoでの消化管内容物の移動・排泄時間の測定を、CNP投与群、未投与群、賦形剤群で比較を行う。