2018 Fiscal Year Annual Research Report
小胞体ジスルフィド還元酵素ERdj5の還元メカニズムの解明
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17J05866
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Research Institution | Kyoto Sangyo University |
Principal Investigator |
上垣 日育 京都産業大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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Keywords | 小胞体 / レドックス |
Outline of Annual Research Achievements |
リボソームから合成される新生鎖は小胞体に挿入された後、様々な小胞体分子シャペロンによって正しく折りたたまれる。小胞体で新生鎖を折りたたむには、タンパク質の立体構造を安定化させるジスルフィド結合形成が重要であり、小胞体のレドックス環境はそのジスルフィド結合形成の触媒反応を促進するため、酸化的な環境に維持されている。このような環境にもかかわらず、ERdj5は小胞体で還元酵素としてはじめて同定され、その還元活性によって小胞体恒常性維持に重要な役割を果たしている。しかし、酸化反応が有利な小胞体でERdj5に還元力を供給するメカニズムは未解明のままであった。私は質量分析によってERdj5の還元ドナー候補タンパク質として小胞体酸化酵素Ero1を同定した。さらに、ERdj5がEro1によって還元されることを明らかにし、Ero1がERdj5の還元酵素であることを示した。Ero1は新生鎖の酸化酵素であるPDIを介して新生鎖から電子を奪い、奪った電子を分子状酸素へ受け渡し、過酸化水素を産生する。そこで、溶存酸素測定系を立ち上げ、Ero1による酸素消費に対するERdj5の影響を観察した。その結果、ERdj5はEro1の酸素消費を抑制し、Ero1から分子状酸素へ受け渡す電子を奪うことが見出された。細胞内では小胞体に挿入される新生鎖がEro1の電子供給源である。新生鎖の合成を阻害した細胞では、ERdj5のレドックス状態が阻害時間依存的に酸化型へ移行することを見出した。このことから、小胞体に挿入される新生鎖の電子はERdj5の還元力として利用されることが明らかになった。この発見は新生鎖と共役した新しい小胞体還元力供給機構であり、小胞体レドックス分野において大きなインパクトを与えると考えている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度、質量分析を用いた網羅的解析によってERdj5の還元ドナー候補因子として小胞体酸化酵素Ero1を同定した。免疫沈降実験により、Ero1はERdj5のTrx3とTrx4の活性中心に対して特異的に結合することを見出した。さらに、PEGシフトアッセイを用いて、ERdj5のTrx3とTrx4の活性中心がEro1によって特異的に還元されることを明らかにした。新生鎖から電子を奪ったEro1はその電子を分子状酸素へ放出し、酸素消費を行う。本年度、Ero1による酸素消費に対するERdj5の影響を観察するため、Ero1、PDIとERdj5のリコンビナントタンパク質を精製し、溶存酸素を測定した。まず、ERdj5のリコンビナントタンパク質は、哺乳類細胞安定発現株を用いて精製した。PDIとEro1は大腸菌発現系を用いて、精製した。Ero1の酸素消費を観察するには、還元型PDIが電子供給源として必要なため、還元剤であるDTTをPDIに処理し、還元型PDIを作製した。これらリコンビナントタンパク質を用いて、Ero1の酸素消費を観察した。還元型PDIと反応させた条件では、Ero1による効率の良い酸素消費が観察された。さらに、その系にERdj5を加えると、Ero1による酸素消費が著しく阻害される結果を得た。このことから、ERdj5はEro1が分子状酸素へ電子を移行するタイミングで、電子を奪うことが見出された。細胞内では、小胞体に挿入される新生鎖がEro1の電子供給源である。そこで、新生鎖がERdj5の電子供給源として利用されるのではないかと考え、新生鎖の合成阻害を行い、内在性ERdj5のレドックス状態を観察した。その結果、ERdj5のレドックス状態は新生鎖の合成阻害によって酸化型に移行した。
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Strategy for Future Research Activity |
小胞体に挿入される新生鎖はPDIを代表とする小胞体酸化酵素群によってジスルフィド結合が形成され、その形成過程で生じた電子はPDI-Ero1経路を介して分子状酸素へ受け渡される。このようにPDI-Ero1経路は小胞体の主要な酸化的フォールディング機構として役割を果たしている。現在までの進捗状況に記載した通り、Ero1は小胞体ジスルフィド還元酵素ERdj5に結合し、ERdj5の還元活性中心を特異的に還元することを見出した。さらに、ERdj5の還元力はEro1による新生鎖の酸化的フォールディングによって生じた電子から供給されることを見出した。これらのことから、小胞体に挿入される新生鎖の電子はERdj5の還元力として利用されることを見出した。今後の研究方針としては、新生鎖による還元力の導入を直接的に証明するため、一過的発現によりシステインを有する新生鎖の合成量を増やし、ERdj5のレドックス状態をPEGシフトアッセイにより測定する。また、ERdj5はEro1による過酸化水素の産生を抑制することが予測される。そこで、小胞体内の過酸化水素インジケーターであるER-hyperを用いて、Ero1による過酸化水素の産生に対するERdj5の影響を観察する。Ero1によるERdj5へ電子リレーの生物学的意義に迫るため、Ero1の過剰発現もしくはノックダウンを行い、ERdj5による小胞体関連分解やカルシウム制御機構への影響を観察する。これらの研究成果をまとめ、英文学術誌への投稿を目指す。さらに、Ero1によるERdj5への電子伝達を構造学的見地から観察するため、精製したERdj5-Ero1複合体のX線結晶構造解析に挑戦する。研究内容に関しては、発表用スライドを作成し、国内外での学会発表を積極的に行う予定である。
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Research Products
(1 results)