2018 Fiscal Year Annual Research Report
ウイルス侵入における細胞膜形態―分子局在―シグナル伝達の時空間同時可視化解析
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17J07984
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
吉田 藍子 北海道大学, 医学研究院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | 高速原子間力顕微鏡 / インフルエンザウイルス / エンドサイトーシス / 細胞膜動態 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018年度は、インフルエンザウイルス粒子の宿主侵入における細胞膜形状変化と宿主因子の集積を可視化解析するとともに、細胞膜形状変化とシグナル伝達の関係性について解析を開始した。主な実績は以下である。
【ウイルス取り込み過程における膜形態変化と力発生機構の解明】3種類の異なる亜型のウイルス粒子について、精製法と蛍光ラベル法を確立し、共焦点顕微鏡一体型ライブセル高速原子間力顕微鏡（AFM）により、ウイルスと宿主の相互作用インターフェースの動態を観察した。結果、1. ウイルスの種類によって粒子のサイズや形状のばらつきが異なること、2.同じ種類のウイルスであっても粒子の構造が不均一な場合には、構造の違いにより宿主への侵入に付随した膜動態が異なることなどを明らかにした。膜形状変化とエンドサイトーシス関連タンパク質群の動態の相関イメージング、および阻害薬を用いた実験により、一部の膜動態を支える力発生因子の同定に至った。
【ウイルスの膜への吸着により惹起される一連のシグナル伝達及び膜形状変化の時空間的関係解明】上皮成長因子受容体（EGFR）は基質であるEGFとの結合によって下流へのシグナル伝達を開始するとともに、エンドサイトーシスを亢進する。EGF刺激によりエンドサイトーシスを誘発すると、クラスリンで被覆された膜のくぼみ（CCP）の分裂や度重なる出現を経て、CCPがクラスター化する様子が観察された。クラスター化は、400~800 nmの膜領域の範囲であり、EGFR阻害薬によって抑制された。これらの結果は、細胞膜にはエンドサイトーシスを効率的に行うために予めプログラムされたドメインが存在しており、この膜ドメインはEGFRの活性によって維持されることが示唆された。
これらの実績から、細胞膜動態へのシグナル伝達の寄与およびウイルス粒子侵入に付随する膜動態の力発生機構の一端を明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は当初の計画通り、細胞膜動態とシグナル伝達の関係、ウイルス侵入を支える膜動態の力発生機構の探求を行い、今後の「ウイルス感染初期における宿主機構の解明」への足掛かりとなる重要な知見を得た。したがって、全体の研究はおおむね順調に進んでいるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2018年度の進展を元に、引き続き「ウイルス感染初期段階における宿主機構の解明」へ向けて、以下の計画を推進する。
【ウイルスの膜への吸着により惹起される一連のシグナル伝達及び膜形状変化の時空間的関係解明】
ウイルス―宿主細胞相互作用により発動される一連のシグナル伝達と、ウイルスが細胞内部へと取り込まれる過程とを同時空間的に解析し、両者の時空間的な関係を明らかにする。シグナル伝達の解析にはBiFCやFRET等のイメージング技術を、得られた事象の上下関係の検証には、ノックアウトやノックダウン、阻害薬等を用いる。
【ウイルス取り込み過程における膜形状変化と力発生機構の解明】
2019年度は、シグナル伝達発動と膜の力学特性の双方に直接関与する脂質分子をターゲットとして、脂質分子の分布変化と膜動態を蛍光顕微鏡一体型高速AFMを用いて観察する。脂質分子によってリクルートされる膜裏打ちタンパク質群を蛍光タグし、膜形状と脂質分子・タンパク質局在の時空間的関係を明らかにする。膜形状変化と高い相関を示すタンパク質を標的とした阻害薬やノックダウンした際の膜形状変化を可視化・解析することで、ウイルス取り込み過程における力学発生機構を明らかにする。
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