2018 Fiscal Year Annual Research Report
リガンド依存的な濃度変化を利用したタンパク質の機能制御
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17J08108
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
木村 友紀 千葉大学, 融合理工学府, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | バイオセンサ / 融合タンパク質 / 化学シャペロン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
有価物質を効率よく生産する改良型微生物を探索するために，転写因子を用いて有価物質そのものや前駆体となる化合物の細胞内濃度を定量する試みが行われてきた。しかしながら，必ずしも標的分子を認識して機能する転写因子が存在するとは限らず，転写因子をそのままバイオセンサとして適用するには限界があった。そこで，タンパク質がリガンドと結合すると構造安定性が向上するという普遍的事実に基づいて，結合安定化に伴う実効濃度変化を利用したセンサ開発を進めてきた。本年度は特に，この実効濃度変化というモードで駆動するセンサ開発において，結合素子に酵素を適用できるかどうかを調査した。酵素をも結合素子として採用できれば標的にできる代謝物の数は飛躍的に増え，代謝工学をはじめ，さまざまな分野で利用されると期待される。
第1年度の研究で得た亢進型転写因子LuxR変異体へさらにランダム変異を導入し，適度に不安定化させ，かつsuper activatorして振る舞うように改変した。この改変型LuxRにいくつかの転写因子を融合したところ，細胞内の標的分子濃度の上昇に応じてLuxRの転写亢進レベルが上昇することが分かった。
さらに，LuxRと融合することによって酵素さえもセンサ素子として振る舞い得ること，そしてそれらにランダム変異を導入すると性能がさらに高まることも分かった。酵素がセンサ素子として使い得るということは，天然・人工を問わず，代謝ネットワーク内のあらゆる代謝物に対してオンデマンドなセンサ開発が可能なことを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
基質結合に伴う実効濃度変化というモードで代謝物センサを作製するためにさまざまな酵素をLuxRに融合してランダム変異を導入することによって，センサ性能のみならず酵素活性を向上させられることが分かった。あらゆる酵素でこうした変異体が得られるかは不明だが，投資価値有りと判断されたため，本年度の進捗は概ね順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は主に，（1）リガンド結合に伴う実効濃度変化を利用した代謝物センサの工法確立，および（2）作製するセンサを利用した代謝工学への応用，の2つに注力する次第である。
（1）サイズ，複合体形成の有無，酵素番号などの観点からさまざまな酵素を選出し，LuxRと融合したときにセンサとして振る舞うかどうかを調べる。得られる結果をもとに，センサ性能を高めるために必要な変異の種類について整理し，実効濃度変化を駆動力とする代謝物センサの作製指針を固める。
（2）酵素をも結合素子として採用することによって，あらゆる代謝物をGFP蛍光に置き換えることが可能になる。これまではクロマトグラフィなどによって初めて検出されていた代謝物も細胞ベースで可視化することが可能となり，任意酵素の進化工学をハイスループットに行うことができるようになる。そこで，（1）で作製するセンサを用いて，その標的代謝物を生産する酵素のランダム変異ライブラリの中から，高活性変異体の取得を試みる。
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Research Products
(1 results)
