2017 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質のバルクリン酸化とその水和効果から理解する分裂期染色体構築機構
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17J09002
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山崎 啓也 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| Keywords | リン酸化 / 分裂期リン酸化 / 質量分析 / 染色体凝縮 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、分裂期移行に伴う染色体関連タンパク質のバルクリン酸化の役割を、DNAとタンパク質が高濃度で存在する環境における、リン酸基周辺の水和効果から解明することにある。採用第1年目の本年は、分裂期バルクリン酸化の定量解析に取り組んだ。
1. 分裂期バルクリン酸化の定量解析
1-1. タンパク質リン酸化特異的プローブによる、分裂期バルクリン酸化量の定量解析
タンパク質リン酸化特異的プローブを用いて、分裂期同調HeLa細胞と、非同調（間期）HeLa細胞のタンパク質リン酸化量の絶対定量を行った。分裂期同調HeLa細胞では、非同調（間期）HeLa細胞と比較して1.4倍のタンパク質リン酸化が起こっていた。ATP濃度感受性FRETプローブを用いた顕微鏡観察では、分裂期中期の開始に向けて細胞内ATP濃度が減少していることが確認された。阻害剤を使用した実験により、分裂期リン酸化が細胞内ATP減少の主要因であることが示された。
1-2. 定量的プロテオミクスによる、分裂期バルクリン酸化部位の定量解析
定量的プロテオミクスにより、分裂期同調細胞と非同調（間期）細胞のリン酸化の比較定量解析を行なった。分裂期への移行に伴い、細胞内タンパク質のリン酸化残基が増加することが示された。また、同一タンパク質内での複数のリン酸化が分裂期リン酸化の特徴の1つとして抽出された。リン酸化部位の構造的特性及びアミノ酸の保存性解析からは、部位特異的なリン酸化による厳密な機能・構造制御と、部位非特異的なリン酸化によるバルクな効果という、2つの異なる役割が示唆された。さらに、リン酸化部位のモチーフ解析を行ったところ、天然変性領域内に存在する非典型的なモチーフが検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、研究課題の第1項目あたる「分裂期バルクリン酸化の定量解析」に取り組み、来年度に繋がる大きな成果が得られている。分裂期におけるタンパク質リン酸化については、リン酸化部位の総数が間期と比較して増加することが知られていたものの、その絶対量に関しては不明であった。今回、タンパク質に付加されたリン酸基に特異的なアフィニティーを持つプローブを用いることにより、分裂期リン酸化の絶対量を得ることに成功した。さらに、定量的リン酸化プロテオミクスにより、各リン酸化部位に関して、分裂期と間期の比を定量し、分裂期に増加するものと減少するものを洗い出すことに成功した。そして、これらの部位がタンパク質の非構造領域に多く存在していることを明らかにした。これらの結果は分裂期特異的なリン酸化の性質を知る上で重要な成果であり、大いに評価できる。今年度に得られた結果は、次年度以降の課題項目の遂行に非常に有用であり、さらに大きな成果が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、分裂期バルクリン酸化と水和効果の観点から、部位非特異的なリン酸化の分裂期における役割を明らかにすることを目指す。また、分裂期において、天然変性領域で特徴的に見られた非典型的モチーフをリン酸化するキナーゼ群の解明をする。
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