微生物群集バイオフィルムにおける遺伝子変異・水平伝播の動態解明

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17J10413
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 中村 祐哉 東京工業大学, 生命理工学院, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2017-04-26 – 2020-03-31
• Keywords: バイオフィルム / 微生物群集 / 遺伝子変異 / 遺伝子水平伝播

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、Nakamura et al.,2016における実験室環境において継続的に培養可能な微生物群集バイオフィルムサンプルを用いて連続培養し、時系列サンプリングを行う。獲得したサンプルからDNAを抽出し、次世代シーケンサーによる大量配列解読することで、バイオフィルムに含まれている微生物群集の遺伝子変異・水平伝播を検出、解析する。これによって、先行研究にて報告されていたバイオフィルムにおける遺伝子変異・水平伝播の促進の実態を観察し、その動態解明を目指す。
微生物群集バイオフィルムサンプルを滅菌済みのナイロンビーズをいれた1/3の濃度の液体LB培地で、48時間、28°C、静置培養の条件で培養した。培養後、バイオフィルムが表面に形成したナイロンビーズを新たな滅菌済みのナイロンビーズをいれた1/3の濃度の液体LB培地に移動し、同条件での培養を繰り返した。バイオフィルムの継代は15回行われ、そのうち1、3、10、15回目に培地に含まれる微生物群集の菌体を採取した。また、微生物群集における遺伝子変異・水平伝播をバイオフィルム状態と浮遊状態で比較解析するために浮遊状態での連続培養も行い、バイオフィルムと同様に継代は15回行われ、そのうち1、3、10、15回目に培地に含まれる微生物群集の菌体を採取した。これにより獲得した各時系列における微生物群集の菌体から、全ゲノムDNAを抽出し、illumina社MiSeqにより配列解読を行った。得られた配列データから高精度な配列のみを抽出後、サンプルごとにアセンブルを行い、ゲノムを再構築した。更に、これらのデータを用い、ゲノム中の変異を検出するツールであるMIDASを用いて、各サンプル中の細菌種に存在する全遺伝子変異を検出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度に実験室環境において継続的に培養可能な微生物群集バイオフィルムサンプルを継代培養し、解析に必要となるデータを収集した。昨年度は、初年度に得たデータを使用し、微生物群集バイオフィルムサンプル内での遺伝子変異の蓄積を検出した。昨年度は、それに加えて、遺伝子水平伝播のデータ解析も進めていく予定であったが、これについては、一部手法の検討までで、実質的なデータ解析までは及んでいない。その理由としては、昨年度、複数の遺伝子変異検出手法が開発され、これについての本研究への応用性検討等を行っていたため、遺伝子変異解析に時間がかかってしまったことが挙げられる。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までに、微生物群集バイオフィルムサンプルをバイオフィルム状態、及び浮遊状態で1ヶ月間培養・時系列でサンプリングを行った。採取したサンプルからDNA抽出し、次世代シーケンサーMiSeqにて配列解読した。また、これにより得られたデータに対し、各細菌の遺伝子ごとに時系列による遺伝子変異の蓄積を追跡し、バイオフィルムと浮遊細胞における遺伝子変異の頻度差を算出した。これにより、変異頻度の大きい遺伝子の同定も行った。その結果、特定の生物種の中で、バイオフィルムにおいて変異の蓄積が確認された。本年度は、これらの結果についてさらなる解析を加え、また、水平伝播の起こった遺伝子の同定も進めていく予定である。更に、そこまでの内容をまとめて、学会報告、または論文報告する予定である。昨年度は、次世代シーケンサーを用いた微生物群集に対するデータ解析において、株レベルでの解析を行うための手法が、複数開発された。これらの手法は、本研究を更に深めていくために非常に有意義なツールとして利用することができると思われる。本年度は、これらの手法も応用し、より詳細に微生物群集バイオフィルムにおける遺伝子変異・水平伝播の実態を明らかにしていく予定である。