浸透圧負荷に対する血管内皮細胞の応答のバイオメカニクス

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K01381
• Research Institution: Aino University
• Principal Investigator: 宮崎 浩 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (00263228)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 浸透圧 / 内皮細胞 / バイオメカニクス / アクチンフィラメント / 力学的特性

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，高張液・低張液による浸透圧負荷が，血管内皮細胞のF-アクチン／ストレスファイバー構造および力学的特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。
1) 流れを負荷した細胞のマイクロピペット吸引試験法の改良：　細胞のマイクロピペット吸引試験を行うためには，培養ディッシュ底面に接着している細胞を剥離させて回収する必要がある。特に流れを負荷する実験群では，流路中央付近に存在し流れが負荷された細胞のみを，大きなダメージなく回収して試験チャンバーに投入しなければならず，細胞を回収する方法の確立が解決すべき課題の一つとなっていた。Trypsin，Trypsin代替液，セルスクレイパーを用いてヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）の剥離を行い，限定された領域の細胞を低ダメージで回収する方法を探った。その結果，回収したい領域外の細胞をセルスクレイパーで除去した後に，残った接着細胞をTrypsin代替液で剥がす方法が最も適していることがわかった。
2) 低張液による流れ負荷が培養内皮細胞の力学的特性に及ぼす影響：　HUVECsを24時間静置培養した後に，平行平板型流れ負荷装置を用いて，この細胞に等張液または低張液によって4時間の流れ負荷（せん断応力 = 2 Pa）を作用させた。その後，流路中央部の細胞を回収して細胞のマイクロピペット吸引試験を行った。低張液中に静置した細胞の弾性係数は小さくなる傾向にあったが，流れを負荷すると，その程度が軽減される傾向がみられた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

COVID-19への対応による教育業務の増大および派生する問題への対処のために，まとまった実験時間を連日確保することが難しかったこと，細胞骨格のライブイメージングのためのトランスフェクション法の確立に時間を費やしていることが，進捗が遅れている主な理由である。

Strategy for Future Research Activity

F-アクチンの変化を詳細に調べるためには，ライブイメージングによって同じ細胞で経時的に繰り返しF-アクチンを観察できることが望ましい。そのため，引き続きポリエチレンイミンを利用したHUVECへの蛍光標識アクチン遺伝子の導入条件の確立を進める。HUVECで効率的な導入がみられない場合には，遺伝子導入が比較的容易であるとされるウシ大動脈内皮細胞の使用も検討する。さらに，低張液・高張液による流れ負荷が培養内皮細胞のF-アクチンおよび力学的特性に及ぼす影響を調べていき，サンプル数を増やしていくが，差があまり見られない場合には，流れを負荷する時間を変化させて調べることも考えている。

Causes of Carryover

COVID-19への対応による教育業務の増大および派生する問題への対処のために，まとまった実験時間を連日確保することが難しかったこと，実験を進める過程で必要となった予備実験に時間を要したこと等により，実験をあまり進められなかったため次年度使用額が生じている。これらは，今後の研究推進に必要な物品を購入するための費用に充てる。