2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K01485
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
中谷 直史 藤田医科大学, 総合医科学研究所, 助教 (00421264)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中井 滋 藤田医科大学, 保健学研究科, 教授 (20345896)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨格筋 / 分子スクリーニング / 筋肉内異所性骨化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
藤田医科大学医学部整形外科との共同研究により得られたヒト骨格筋サンプルから、ヒト筋衛星細胞（CD56陽性細胞）、ヒト骨格筋由来間葉系前駆細胞（PDGFRα陽性細胞）の単離、培養を行い、多数の患者由来の細胞株を得ることが出来た。途中、得られる細胞数を増やすため、一部実験系の変更を行った結果、分化度の低下が見られた。そのため、これまでの実験系へ戻し、スタート時の筋組織を増やすことで得られる細胞数を増やす改善を行った。保存に当たりこれまでと同様、CD56陽性細胞は筋管細胞への分化度、PDGFRα陽性細胞は脂肪細胞への分化度、またそれぞれの表面マーカーの発現を確認し、細胞株ごとに保存を行い、これらの細胞を用いて研究を進めた。
29年度に選定し購入した生理活性物質ライブラリーを用いて、ヒト筋衛星細胞、ヒト骨格筋由来間葉系幹細胞を用いたスクリーニングを開始した。先に述べた細胞単離の条件変更により高分可能の筋衛星細胞を得るのに時間を要したため、先に間葉系前駆細胞を用いた筋肉内異所性骨化抑制分子スクリーニングを行った。173種類の天然成分から骨分化の抑制効果が見られる分子の探索を行った。ヒト間葉系前駆細胞を骨分化誘導培地で分化誘導を行い、そこへ173種類の天然成分をそれぞれ加え、ALP測定、アリザリンレッド測定を行うことで分化度を定量した。その結果、ALP測定、アリザリンレッド測定で共通して骨分化抑制効果が見られた4分子と、各々で最も抑制効果の高かった2分子の計6分子において、濃度依存による抑制効果を調べた。その結果、2分子が濃度依存性の抑制効果を示した。また、この2分子は細胞毒性もないことがWST-8試験から確認することができたが、2分子のうちの1つは、細胞毒性は見られないが細胞形態が変化していたため、候補から除外し今後のIn vivoの骨分化抑制効果を調べる候補分子を1分子に絞った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
筋衛星細胞の保存細胞数を増やすための条件検討に時間がかかってしまった。処理する骨格筋量を増やすことで問題は解決されたが、筋衛星細胞を用いた分子スクリーニングに取り掛かるのが遅れてしまった。そのため、筋衛星細胞に比べ安定して高分可能を保った状態で単離できる、間葉系前駆細胞を用いた筋肉内異所性骨化抑制分子のスクリーニングを先に行った。前年度選定し購入した１７３種類の天然成分由来ライブラリーを用いて１stスクリーニングを行い、骨分化抑制効果のある６分子を絞り込み、２ndスクリーニングとして濃度依存性効果、細胞毒性試験を行った結果、骨分化抑制効果のある１分子を見つけることができた。スクリーニングと並行し、外科処置による異所性骨発生モデルマウスの作製に取り組んだ。骨の発生を、マイクロCT、病理学的解析（HE、コッサ染色）を用いて確認することができた。次年度はIn vivoの異所性骨モデルを用いて作用を検討中である。筋衛星細胞を用いたスクリーニングに用いる筋萎縮患者の血清については、サンプリングを行う関連施設と連携を取り、次年度に採取を行える状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト骨格筋由来細胞を用いた分子スクリーニングについて、筋衛星細胞を用いたスクリーニングを最終年度に行う。実験方法の変更で分化度低下問題がみられたが改善することができた。筋衛星細胞を用いたスクリーニングは、①天然成分ライブラリーを用いた筋形成促進分子の探索、②筋萎縮患者血清による筋萎縮因子の探索の２点を推進する。筋萎縮患者血清は、長期透析患者から得たものを使用する。分化した筋管細胞をMHCで蛍光染色し、筋管細胞の肥大、萎縮をイメージアナライザーで検出する実験系はすでに構築済みである。この実験系を用いて①、②のスクリーニングを行う予定である。間葉系前駆細胞に関しては30年度に絞り込んだ分子の骨分化抑制効果をIn vivoで評価を行い、作用メカニズムの解明を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
使用する細胞単離に時間を要したため実験計画が少し遅延し、当初予定していた細胞の遺伝子発現解析、In vivoの動物実験が行えなかった。繰越分は予定通り次年度使用する予定である。
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[Journal Article] Reduced expression of calcitonin receptor is closely associated with age-related loss of the muscle stem cell pool.2019
Author(s)
Ikemoto-Uezumi M, Uezumi A, Zhang L, Zhou H, Hashimoto M, Okamura K, Matsui Y, Tsukazaki K, Hosoyama T, Nakatani M, Morita M, Yamada H, Tsuchida K, Fukada S.
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Journal Title
JCSM Rapid Communications
Volume: 2
Pages: -
Peer Reviewed
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[Journal Article] UBL3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles.2018
Author(s)
Ageta H, Ageta-Ishihara N, Hitachi K, Karayel O, Onouchi T, Yamaguchi H, Kahyo T, Hatanaka K, Ikegami K, Yoshioka Y, Nakamura K, Kosaka N, Nakatani M, Uezumi A, Ide T, Tsutsumi Y, Sugimura H, Kinoshita M, Ochiya T, Mann M, Setou M, Tsuchida K.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 9
Pages: 3936
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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