2019 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of NBD-labeled peptides by using photo irradiation-induced NBD loss
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17K01956
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
淺沼 三和子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 技師 (70381598)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 質量分析 / 蛍光 / 標識 / 標的タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
すでに開発している、生物活性化合物の標的タンパク質選択的にNBD蛍光基を結合させる蛍光アフィニティー標識法（O-NBD法）を用いて、NBD標識されたタンパク質を質量分析法で同定することは可能であったが、NBD修飾部位を明らかにすることは容易でなかった。本研究では、光照射によりNBD標識ペプチドからNBD蛍光基が脱離する現象に着目し、液体クロマトグラフ-質量分析計（LC-MS）を用いたNBD標識ペプチド選択的な検出・分析法を確立し、NBD標識ペプチドの同定すなわちタンパク質のNBD修飾部位の同定を目指している。
最終年度はミトコンドリア外膜の膜タンパク質であるトランスロケータータンパク質（TSPO）にO-NBD法を適用し、培養細胞中でNBD標識されるタンパク質およびNBD修飾部位の同定を試みた。O-NBDユニットを導入したTSPO阻害剤で処理した培養細胞を可溶化したのち、SDS-PAGE電気泳動分離し蛍光ゲルイメージを取得した。蛍光を示すゲルバンドのゲル内消化を行い、ペプチド混合物を調製し、前年度までに確立したNBD標識ペプチド回収法で処理した。得られたペプチド試料を蛍光検出器を備えたLC-MSで分析し、mascot serverによるデータベース検索を行った。その結果、数種のNBD標識ペプチドの同定に成功した。期間内において、使用予定のLC-MSに不具合が生じたこともあったが、試料調製法の確立を優先させ実サンプルへの適用を進めた結果、NBD標識ペプチドの同定およびNBD修飾部位の同定に至った。
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