Low-cost degradation of azo dyes using the artifitial multi-domain enzymes immobilized on the sheet.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K05936
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 講師 (90322825)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: タンパク質工学 / アフィニティークロマトグラフィー / 固定化酵素 / プロテインライゲーション / カードラン

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度は，Staphylococcus aureusおよびStreptococcus pyogenes Sortase Aを2段階で反応させたプロテインライゲーションによって，グルコキナーゼ (GLK)，グルコース-6-リン酸脱水素酵素 (ZWF) およびアゾレダクターゼ (AZR) の3種類の酵素の接続を試みた．当初，2段階目の反応が進まなかったことから，新たに各酵素の両末端にリンカー配列(GGGGS)x3を加えたところ，3種類すべての酵素を接続した人工マルチドメイン酵素であるAZR-ZWF-GLKを得ることができた．このマルチドメイン酵素をNiおよびカードランによる2段階のアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し，NADPHの再生活性およびアゾ色素の分解活性を測定したところ，両方の活性が認められた．しかしながら，3種類目の酵素の接続反応の収率が低いことから，工業利用における大量生産を行うためには，さらなる反応条件の改善が必要である．
また，昨年度に引き続き，ワンチューブでのNADPH再生反応およびアゾ色素分解反応のNMRによる同時解析を進めた．各酵素の基質であるグルコース，ATP，NADPHおよびメチルレッドおよびその反応物に由来する複数のシグナルを新たにアサインメントすることができ，これらのシグナルを用いることで，時系列での分解過程における基質の確認精度を高めることができた．
好冷菌の酵素について，さらなるデータベース解析を行い，当初の候補遺伝子以外にも複数の候補遺伝子があることがわかったため，それらについても大腸菌発現プラスミドの構築を行った．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目的としていたアゾ色素の多段階の分解過程のNMRによる解析を進めることができたため．

Strategy for Future Research Activity

最終年度は好冷菌に由来する複数の遺伝子の生産および活性の確認を行う．活性のある酵素は，人工マルチドメイン酵素に組み込み，至適温度や基質特異性を調べて，工業的な応用ができるかどうか調べる．大腸菌により発現が困難な酵素については，酵母を用いた発現も試みる．活性の確認できた人工マルチドメイン酵素を大型カードランシートに固定化し，数リットルのアゾ染料の分解モデルを構築する．

Causes of Carryover

昨年度および今年度は，大学業務の関係で，国外での学会発表の都合がつかず，次年度の国外出張に利用することとしたため．

Research Products

• [Presentation] Real-time NMR analysis of the continuous degradation process of azo dyes using azoreductase in cooperation with the NADPH regeneration system. (2019)
  • Author(s): Horiuchi, M., Nagata, T., Katahira, M., Kobashigawa, Y., Suzuki, Y., Ochiai, M.
  • Organizer: The 9th International Symposium of Advanced Energy Science
  • Int'l Joint Research